培养类器官的方法技术

本发明专利技术提供了一种培养类器官的方法，该方法包括：a)解离未经处理的类器官以产生细胞悬浮液；b)通过细胞过滤器筛选细胞悬浮液以保留含有直径约10μm至约1mm的细胞的筛选后的细胞悬浮液；和c)将筛选后的细胞悬浮液的细胞接种到在含有细胞外支持基质的细胞培养基的生物反应器中。

Method of cultivating organoid

The present invention provides a method for cultivating organ-like organs. The method includes: a) dissociating untreated organs to produce cell suspension; b) screening cell suspension through cell filter to retain the screened cell suspension containing cells with a diameter of 10 to 1 mm; and c) inoculating the cells with the screened cell suspension into cell culture containing extracellular support matrix. A nutrient-based bioreactor.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】培养类器官的方法
本专利技术涉及一种培养类器官的方法。
技术介绍
在动物或人类体内测试新药候选物之前，通常使用原代细胞培养物或细胞系进行体外测试。然而，由于细胞培养物不能非常好地模拟体内系统，这种测试的结果可能是不可靠的。这可能导致一些好的药物在体外阶段被舍弃，并且一些不良药物可能会进展到体内试验。类器官是异质性组织的三维结构，其功能类似于体内组织。换句话说，这些组织的三维结构模拟一种器官优于传统的细胞培养单层。因此，类器官提供了创建细胞疾病模型的机会，可以对其进行研究以更好地了解疾病的原因并确定可能的治疗方法。类器官通常由干细胞产生，干细胞可分化为脑、肾、心血管和其他类型的类器官。类器官技术也被用于创建人类结肠癌进展的模型。这些类器官可以从正常的肠细胞进行突变以转化成癌细胞而产生，或者可以从肿瘤细胞本身获得。已经证实从肿瘤中产生的类器官是该原始肿瘤的良好映射，其为改进体外药物测试提供了机会。然而，迄今为止，类器官仅被在实验室环境中进行培养，这严重依赖于相关技术人员的技术技能，并仅产生少量类器官。因此，无法大量提供可应用于药物测试中的类器官。此外，由于依赖于培养过程中的技术技能，培养物之间几乎没有标准化，这意味着对不同批次的类器官进行的测试可能无法直接比较。因此，需要产生大量的类器官，并产生具有一致形式和功能的类器官。这将有助于在药物测试中更广泛地使用类器官，从而提高测试结果的可比性。专利技术总述因此，本专利技术提供了一种培养类器官的方法，该方法包括：a)解离未经处理的类器官以产生细胞悬浮液；b)通过细胞过滤器筛选细胞悬浮液以保留含有直径约10μm至约1mm的细胞的经筛选后的细胞悬浮液；和c)将筛选后的细胞悬浮液的细胞接种到在含有细胞外支持基质的细胞培养基中的生物反应器中。细胞悬浮液的筛选提供了特别的优势，即可以控制筛选细胞的尺寸范围。例如，从活跃生长的细胞中挑选窄尺寸范围的细胞接种至细胞培养基中能够得到具有一致的尺寸/表面积与体积比的均质性类器官的培养物，导致可变性降低并且质量得到改善。不受理论束缚，据信可优化细胞/类器官的尺寸以确保所有类器官与细胞外支持基质有良好接触，以及良好的营养物通入和良好的O2张力。这确保了类器官的所有细胞均有适当地发育并且具有高质量，意味着更大数量的类器官可用于各种应用，例如药物筛选。
技术实现思路
术语类器官仅仅意味着与器官类似。类器官通常通过三个特征定义：自组织、多细胞性和功能性(Lancaster和Knoblich)。因此，细胞在体外排列成具有体内器官特征的三维(3D)组织，所得结构由在该特定器官中发现的多种细胞类型组成，并且这些细胞至少执行一些其通常在该器官中执行的功能。例如，一种原型类器官如小鼠肠类器官，作为单层上皮细胞生长，并被组织成多个区域，使其类似于体内肠道隐窝-绒毛结构，其包括肠的不同细胞类型(肠细胞、杯状细胞、潘氏细胞，肠内分泌细胞和干细胞)，并包围一囊腔(Sato等)。本专利技术中，未经加工的类器官是指从组织样品的原代培养物制备得到的类器官，其在培养期间未经过任何筛选或分选的步骤。未经加工的类器官可以分离自组织样品，包括消化道、乳房、前列腺、肺、肝、卵巢、胰腺、皮肤、肾、脑和睾丸的正常或癌症的活检组织。本专利技术中，未经处理的类器官被解离以将它们分解成(大体上)单细胞。通过过筛后，过滤器上会留下较大的团块。滤液(即筛选的细胞悬浮液)可能主要包含单个细胞和/或两个或更多个细胞的小团块，其直径可以为约10μm至约1mm，优选直径为约10μm至约200μm，更优选直径为约10μm至约60μm。然后将它们接种在包含细胞外支持基质的细胞培养基中。在培养基中进一步生长后，活细胞分裂并成为多细胞类器官(在本专利技术中称为I阶段类器官)。这些可以从细胞外支持基质中整体“回收”并通过各种尺寸的筛子，以提取所需尺寸范围从约20μm至约200μm的类器官(II阶段类器官)，如下所述。解离未经加工的类器官可以指使用胰蛋白酶进行细胞解离的过程，胰蛋白酶是一种蛋白水解酶，其剪切蛋白质，使贴壁细胞彼此之间和/或与培养它们的容器解离。当添加到细胞培养物中时，胰蛋白酶分解蛋白质，使细胞能够粘附到血管上。胰蛋白酶消化通常用于将细胞传递至新血管。作为替代/互补的解离技术，包括EDTA在内的螯合剂可用于破坏细胞-细胞的连接。细胞培养基是本领域熟知的，并且是技术人员熟悉的。通常，细胞培养基包含氨基酸、盐、葡萄糖和维生素，并且还可包含铁和酚红。适合用于本专利技术的培养基可以通过改进现有的细胞培养基来产生。例如，细胞培养基可以是达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)，并且可以包含一种或多种其他组分，如营养混合物(例如Ham'sF12)、抗生素/抗真菌剂(例如青霉素/链霉素)、缓冲液(例如HEPES)、谷氨酰胺和n-乙酰半胱氨酸。细胞培养基可另外包含无血清补充剂，例如N2补充剂和/或B27补充剂。细胞培养基可包含约1％至约99％v/v的细胞外支持基质，优选约5％至约85％v/v或约10％至约85％v/v的细胞外支持基质。在本专利技术的较佳实施例中，细胞培养基可包含约85％v/v的细胞外支持基质。与现有技术中通常使用100％细胞外基质相比，减少细胞培养基中的细胞外支持基质的含量可以提供优于现有技术的特定的成本优势。令人惊讶的是，本专利技术人发现在本专利技术的方法中，可以降低细胞外基质含量而不损害类器官的生长。较佳地，细胞外支持基质是基于凝胶的细胞外基质，其可以是合成的或天然存在的。可选地或可替代地，细胞外支持基质可以是溶解的基底膜制剂。例如，可以从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取合适的基底膜制剂，该小鼠肉瘤是富含诸如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、恩他汀/巢蛋白和许多生长因子等细胞外基质蛋白的肿瘤。较佳地，细胞外支持基质包含至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或一种胶原蛋白和一种层粘连蛋白。在本专利技术的实施例中，细胞外支持基质可以是MatrigelTM(其包含层粘连蛋白、恩他汀和IV型胶原)基质胶或CultrexTM基底膜提取物(其包含层粘连蛋白、恩他汀、IV型胶原和硫酸肝素蛋白聚糖)。较佳地，细胞外支持基质是MatrigelTM。可选地，细胞外支持基质可以是合成基质，其包含基于纤连蛋白、胶原蛋白和/或层粘连蛋白存在的序列的肽。培养基可以置于细胞外支持基质的顶部，并且可以根据需要除去和补充。在本专利技术的实施例中，生物反应器提供连续的培养基流，从而连续地供给类器官。培养基的组成可以随时间调整，以最大化地使类器官的均匀生长。将未经加工的类器官解离后获得的细胞悬浮液通过细胞过滤器过筛，以保留如上所述的筛选的细胞悬浮液。筛选的细胞悬浮液的细胞可以是单细胞，或者可以是两个或更多个细胞结合形成的类器官。筛选的细胞悬浮液的细胞或类器官的大小可以通过细胞过滤器的筛孔尺寸来控制。例如，细胞过滤器可具有约10μm至约1mm或约10μm至约500μm的筛孔尺寸。优选地，细胞过滤器的筛孔尺寸为约20μm至约100μm，更优选约30μm至约50μm。在本专利技术的实施例中，如果在筛选的细胞悬浮液中主要需要单细胞时，细胞过滤器可具有约40μm的筛孔尺寸。合适的细胞过滤器对于技术人员来说是熟悉的并且包括pl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养类器官的方法，所述方法包括：a)解离未经处理的类器官以产生细胞悬浮液；b)通过细胞过滤器筛选细胞悬浮液以保留含有直径约10μm至约1mm的细胞的筛选后的细胞悬浮液；和c)将筛选后的细胞悬浮液的细胞接种到在含有细胞外支持基质的细胞培养基的生物反应器中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.11 GB 1611982.81.一种培养类器官的方法，所述方法包括：a)解离未经处理的类器官以产生细胞悬浮液；b)通过细胞过滤器筛选细胞悬浮液以保留含有直径约10μm至约1mm的细胞的筛选后的细胞悬浮液；和c)将筛选后的细胞悬浮液的细胞接种到在含有细胞外支持基质的细胞培养基的生物反应器中。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器是灌注式生物反应器。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物反应器是进料板生物反应器。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述进料板生物反应器是平板式生物反应器。5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基包含约1％至约99％v/v的所述细胞外支持基质。6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基包含约5％至约85％v/v的所述细胞外支持基质。7.如权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外支持基质是可溶性的基底膜制剂。8.如权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外支持基质是Matri...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽安娜·J·埃利斯，尤利安·乔杜里，特雷沃尔·克利韦·达莱，
申请(专利权)人：塞莱斯有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB