示出葡萄糖依赖性线粒体呼吸和双相胰岛素分泌响应的人多能干细胞衍生的功能性β细胞的产生制造技术

本发明专利技术提供了使胰腺内分泌细胞分化成表达PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3和SLC2A的胰腺β细胞的方法。这些胰腺β细胞可通过对多能干细胞分步分化获得。胰腺β细胞表现出类似于胰岛细胞的葡萄糖依赖性线粒体呼吸和葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

Generation of functional beta cells derived from human pluripotent stem cells in response to glucose-dependent mitochondrial respiration and biphasic insulin secretion

The present invention provides a method for differentiating pancreatic endocrine cells into pancreatic beta cells expressing PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 and SLC2A. These pancreatic beta cells can be obtained by stepwise differentiation of pluripotent stem cells. Pancreatic beta cells exhibit glucose-dependent mitochondrial respiration and glucose-stimulated insulin secretion similar to islet cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】示出葡萄糖依赖性线粒体呼吸和双相胰岛素分泌响应的人多能干细胞衍生的功能性β细胞的产生相关申请的交叉引用本申请要求美国临时申请62/352,968(2016年6月21日提交)的优先权，该美国临时申请全文以引用方式并入本文。
本专利技术涉及由多能干细胞的分化所致的产生体外功能性胰腺β细胞和群体的方法。具体地，本专利技术涉及表现出线粒体呼吸/活性响应以及双相胰岛素分泌响应的β细胞或β细胞群。
技术介绍
用于Ⅰ型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得人们把注意力集中在开发适于移植的胰岛素分泌细胞或β细胞的来源上。一种方法是由多能干细胞诸如胚胎干细胞或诱导的多能细胞生成功能性β细胞。在脊椎动物胚胎发育中，多能细胞可在被称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。组织(诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏)将从内胚层经由中间阶段发育而来。D’Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(NatureBiotechnology2005,23:1534-1541；美国专利7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF-10和视黄酸后，这些衍生自人胚胎干细胞的定形内胚层细胞还可进一步分化成PDX1阳性细胞(美国专利申请公布2005/0266554)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞(美国专利7,534,608和7,993,920)。一直以来，使用小分子抑制剂来诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-β受体和BMP受体的小分子抑制剂(Development2011,138:861-871；Diabetes2011,60:239-247)已用于提高胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺内胚层细胞(Curr.Opin.CellBiol.2009,21:727-732；NatureChem.Biol.2009,5:258-265)。一般来讲，祖细胞分化成功能性β细胞的过程经历多个阶段，并且对从祖细胞诸如人多能干细胞生成胰腺细胞的方案的改善已经取得了进展。虽然有这些研究进展，但是祖细胞分化过程中的每一步骤均提出独特的挑战。因此，为了产生功能性胰腺内分泌细胞，并且具体地，功能性β细胞的目的，仍存在对于进一步分化方案发展的需要。具体地，希望提供体外产生功能性β细胞中所观察到的有迅速调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌(“GSIS”)能力的葡萄糖响应型胰岛素生成细胞。具体地，希望提供一种产生如下体外功能性β细胞的方法：表现出线粒体呼吸/活性提高，之后胰岛素分泌的第一时相和第二时相。GSIS从葡萄糖经由葡萄糖转运蛋白(溶质载体家族2，成员1；SLC2A1；或通常称为葡萄糖转运蛋白1；GLUT1，用于人β细胞)转运到β细胞中开始，并且葡萄糖经过称为糖酵解的过程代谢为丙酮酸。丙酮酸转运到线粒体中，其通过TCA(三羧酸)代谢并后续激活电子传递链(“ETC”并且此处称为“线粒体活性”或“线粒体呼吸”)循环而与胰岛素胞吐密切偶联，以确保迅速和恰当量的胰岛素释放。胰岛内的功能性β细胞显示在葡萄糖浓度突然增大时以两个连续相分泌胰岛素(Henquin等人Diabetologia(2009)52(5):739-751)。双相的幅度和持续时间受细胞内Ca2+信号或加性分泌偶联因子的动力学调节。第一时相(1st)胰岛素分泌表示结合和可易于释放的胰岛素颗粒的较小库胞吐。第二时相(2nd)胰岛素分泌(幅度较低但持续时间较长)表示颗粒从颗粒储备库转移，并且它们锚定/引发以释放。双相GSIS，即β细胞成熟的关键标记在人发育的产后阶段前检测不到，并且这不同于在不成熟β细胞中所见的单相GSIS(Otonkoski等人Diabetes(1988)37:286-291)。在2型糖尿病中，GSIS的第1时相不存在；并且GSIS的第2时相也有所下降。已报道β细胞数目经自体免疫攻击而急剧下降的1型糖尿病不含稳健的双相GSIS(Krogvold等人Diabetes(2015)64：2506-2512)。
技术实现思路
如所体现和充分描述的那样，本专利技术提供了由多能干细胞分化所致的产生体外功能性β细胞(功能性胰腺β细胞)和细胞群的方法。具体地，本专利技术涉及产生表现出线粒体呼吸/活性响应以及双相胰岛素分泌响应的功能性胰腺β细胞(产胰岛素细胞)或功能性β细胞群。本专利技术的一个方面是使多能干细胞分化成功能性β细胞的方法。本专利技术的一个特定方面是使胰腺内胚层细胞分化成表达PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3和SLC2A1的功能性β细胞的方法。在实施方案中，该方法包括在补充有UNC0638、UNC0642、UCN0646、TC-E5003、A366、PF03814735、ZM447439、SB747651A、PFI1、LY303511、MS436、AZT、DEZA、吡咯沙敏、CI9994或MC1568中的一种或多种小分子的培养基中培养胰腺内分泌细胞。本专利技术的一个实施方案是通过体外分化胰腺内分泌细胞获得的表达单激素胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA的功能性胰腺β细胞的体外群体。在一些实施方案中，功能性β细胞的群体也共表达UCN3和SLC2A1。在实施方案中，MAFA表达相比于不成熟β细胞是提高的。在实施方案中，功能性β细胞的体外群体通过在补充有UNC0638、UNC0642、UCN0646、TC-E5003、A366、PF03814735、ZM447439、SB747651A、PFI1、LY303511、MS436、AZT、DEZA、吡咯沙敏、CI9994或MC1568中的一种或多种小分子的培养基中培养胰腺内分泌细胞获得。在本专利技术的另一个实施方案是使多能干细胞分化成表达PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3和SLC2A的功能性β细胞的方法，该方法包括以下步骤：使多能干细胞分化成胰腺内分泌细胞；并且使胰腺内分泌细胞分化成表达PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3和SLC2A1的功能性β细胞。在实施方案中，MAFA表达相比于不成熟β细胞是提高的。在一些实施方案中，该方法包括在补充有UNC0638、UNC0642、UCN0646、TC-E5003、A366、PF03814735、ZM447439、SB747651A、PFI1、LY303511、MS436、AZT、DEZA、吡咯沙敏、CI9994或MC1568中的一种或多种小分子的培养基中培养胰腺内分泌细胞。在上述每个实施方案中，培养基还补充有ZM447439、肝素、N-乙酰半胱氨酸、以及制剂I中的一种或多种。在以上实施方案中，培养基还补充有T3、T4及其类似物中的一种或多种。在以上实施方案中，培养基补充有ALK5抑制剂。在以上一些实施方案中，培养基不含ALK5抑制剂。在以上本专利技术的实施方案中，培养基补充有AZT或DEZA。在以上一些实施方案中，培养基补充有AZT和DEZA两者。在上述本专利技术的实施方案中，培养基还补充有γ分泌酶抑制剂。在以上一些实施方案中，培养基补充有T3。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将胰腺内胚层细胞分化成表达PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3和SLC2A1的功能性β细胞的方法，包括在补充有UNC0638、UNC0642、UCN0646、TC‑E5003、A366、PF03814735、ZM447439、SB747651A、PFI1、LY303511、MS436、AZT、DEZA、吡咯沙敏、CI9994或MC1568中的一种或多种的培养基中培养胰腺内分泌细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.21 US 62/3529681.一种将胰腺内胚层细胞分化成表达PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3和SLC2A1的功能性β细胞的方法，包括在补充有UNC0638、UNC0642、UCN0646、TC-E5003、A366、PF03814735、ZM447439、SB747651A、PFI1、LY303511、MS436、AZT、DEZA、吡咯沙敏、CI9994或MC1568中的一种或多种的培养基中培养胰腺内分泌细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基还补充有肝素、N-乙酰半胱氨酸、制剂I、以及T3、T4或其类似物中的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述培养基不含ALK5抑制剂。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述培养基补充有ALK5抑制剂。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基补充有ZM447439、肝素、N-乙酰半胱氨酸、以及T3、T4或其类似物中的一种或多种，并且其中所述培养基不包含ALK5抑制剂。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述培养基补充有T3。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述培养基补充有AZT。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养基补充有DEZA。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述功能性β细胞通过对表达所述定形内胚层的特征性标记物的细胞、表达原肠管细胞的特征性标记物的细胞、表达前肠内胚层细胞的特征性标记物的细胞、表达胰腺内胚层细胞的特征性标记物的细胞、表达胰腺内分泌前体细胞的特征性标记物的细胞、表达不成熟β细胞的特征性标记物的细胞、以及表达功能性β细胞的特征性标记物的细胞中的一种或多种进行分步分化获得。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在空气-液体界面处培养所述细胞。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在悬浮簇中培养所述细胞。12.一种表达单激素胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA的功能性β细胞的体外群体，其通过体外分化胰腺内分泌细胞获得。13.根据权利要求12所述的群体，其中所述细胞还表达UCN3和SLC2A1。14.根据权利要求12所述的群体，其中所述细胞表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌和葡萄糖依赖性线粒体呼吸。15.根据权利要求14所述的群体，其中所述葡萄糖刺激的胰岛素分泌和葡萄糖依赖性线粒体呼吸与人胰岛细胞的类似。16.一种表达单激素胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA的胰腺β细胞的体外群体，其通过在补充有UNC0638、UNC0642、UCN0646、TC-E5003、A366、PF03814735、ZM447439、SB747651A、PFI1、LY303511、MS436、AZT、DEZA、吡咯沙敏、CI9994或MC1568中的一种或多种的培养基中培养胰腺内分泌细胞获得。17.根据权利要求16所述的群体，其中所述培养基还补充有肝素、N-乙酰半胱氨酸、制剂I、以及T3、T4或其类似物中的一种或多种。18.根据权利要求16或17所述的群体，其中所述培养基不含ALK5抑制剂。19.根据权利要求16或17所述的群体，其中所述培养基补充有T3。20.根据权利要求16所述的群体，其中所述培养基补充有ZM447439、肝素、N-乙酰半胱氨酸、制剂I、以及T3、T4或其类似物中的一种或多种，并且其中所述培养基不包含ALK5抑制剂。21.根据权利要求16所述的群体，其中所述培养基补充有T3。22.根据权利要求21所述的群体，其中所述培养基补充有AZT。23.根据权利要求22所述的群体，其中所述培养基补充有DEZA。24.根据权利要求16所述的群体，其中所述细胞还表达UCN3和SLC2A1。25.根据权利要求16所述的群体，其中所述细胞表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌和葡萄糖依赖性线粒体呼吸。26.根据权利要求16所述的群体，其中所述葡萄糖刺激的胰岛素分泌和葡萄糖依赖性线粒体呼吸与胰岛细胞的类似。27.一种使多能干细胞分化成表达PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3和SLC2A的功能性β细胞的方法：a.使多能干细胞分化成不成熟β细胞；以及b.通过在补充有UNC0638、UNC0642、UCN0646、TC-E5003、A366、PF03814735、ZM447439、SB747651A、PFI1、LY303511、MS436、AZT、DEZA、吡咯沙敏、CI9994或MC1568中的一种或多种的培养基中培养不成熟β细胞，使所述不成熟β细胞分化成表达PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3和SLC2A1的功能性β细胞。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述功能性β细胞具有类似于人胰岛细胞的葡萄糖依赖性线粒体呼吸。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述功能性β细胞具有类似于人胰岛细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌。30.根据权利要求27所述的方法，其中所述功能性β细胞以多相分泌胰岛素。31.根据权利要求27所述的方法，其中所述培养基还补充有肝素、N-乙酰半胱氨酸、制剂I、以及T3、T4或其类似物中的一种或多种。32.根据权利要求27或31所述的方法，其中所述培养基不含ALK5抑制剂。33.根据权利要求27或31所述的方法，其中所述培养基补充有T3。34.根据权利要求27所述的方法，其中所述培养基补充有ZM447439、肝素、N-乙酰半胱氨酸、以及T3、T4或其类似物中的一种或多种，并且其中所述培养基不包含ALK5抑制剂。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述培养基补充有T3。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述培养基补充有AZT。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述培养基补充有DEZA。38.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法包括在所述空气-液体界面处培养所述不成熟β细胞。39.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法包括在悬浮簇中培养所述不成熟β细胞。40.根据权利要求27所述的方法，其中所述分化多能干细胞的步骤包括：a.使所述多能干细胞分化成表达所述定形内胚层的特征性标记物的细胞(“第1阶段细胞”)；b.使所述第1阶段细胞分化成表达原肠管细胞的特征性标记物的细胞(“第2阶段细胞”)；c.使所述第2阶段细胞分化成表达前肠内胚层细胞的特征性标记物的细胞(“第3阶段细胞”)；d.使所述第3阶段细胞分化成表达胰腺内胚层细胞的特征性标记物的细胞(“第4阶段细胞”)；e.使所述第4阶段细胞分化成胰腺内分泌前体细胞(“第5阶段”)；以及f.使所述第5阶段细胞分化成所述不成熟β细胞。41.根据权利要求40所述的方法，其中步骤e.和f.包括在所述空气-液体界面处培养。42.根据权利要求40所述的方法，其中所述步骤e.和f.包括在悬浮簇中培养所述细胞。43.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法包括通过在补充有MCX化合物和GDF-8的培养基中培养所述多能干细胞，使多能干细胞分化成第1阶段细胞。44.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法包括通过在补充有FGF7和抗坏血酸的培养基中培养所述第1阶段细胞，使所述第1阶段细胞分化成第2阶段细胞。45.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法包括通过在补充有FGF7、视黄酸、SANT-1、PKC活化剂、BMP抑制剂和抗坏血酸的培养基中培养所述第2阶段细胞，使所述第2阶段细胞分化成第3阶段细胞。46.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法包括通过在补充有FGF7、视黄酸、SANT-1、PKC活化剂、BMP抑制剂和抗坏血酸的培养基中培养所述第3阶段细胞，使所述第3阶段细胞分化成第4阶段细胞。47.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法包括通过在补充有SANT-1、PKC活化剂、BMP抑制剂和抗坏血酸的培养基中培养所述第4阶段细胞，使所述第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述培养基还补充有T3、T4或其类似物中的一种或多种。49.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法包括通过在补充有BMP抑制剂，抗坏血酸，T3、T4或其类似物中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：S瑞克，A瑞扎尼雅，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US