双管状结构制造技术

本发明专利技术涉及使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法。在所述方法中，上皮细胞通过间充质细胞来源的细胞衬贴在所述微流体细胞培养系统中。所述细胞可以形成管状或管样结构，即管中管。所述方法得到适用于广泛的应用的改进的上皮模型，所述应用包括但不限于健康和患病的上皮细胞的高通量筛选和分析等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双管状结构
技术介绍
上皮为形成内部和外部体表的衬里(lining)的特化和极化的组织。形成上皮的细胞紧密压紧并可形成一层或多层。上皮可为一层细胞厚(单层上皮)或两层以上细胞厚(复层上皮)。不同类型的上皮，单层和复层，都基于形状和功能来鉴别，包括鳞状上皮、立方上皮、柱状上皮和移行上皮。通常，称为基膜的结缔组织薄片将上皮与下层组织分隔。基膜为上皮提供结构支持并将其与相邻的结构连接。基膜充当支架，上皮可在其上生长并在受损后再生。上皮组织受神经支配但无血管，上皮必须通过从下层组织中的血管扩散的物质获取营养。基膜充当决定何种物质将能够进入上皮的选择性透过膜。上皮在发育过程中的分化与有序的形态发生事件序列紧密相关。一些实验研究已强调了这些发育过程依赖于相互的上皮-间充质相互作用。存在对上皮屏障组织的体外模型的开发的广泛关注，所述体外模型复制体内所观察到的组构(organization)和限制行为，并且例如将允许它们用于非侵入性、快速、经济和可再生的试验和/或筛选新的候选药物、化学品和食品的用途。然而，重要的信号在细胞于二维塑料基质上离体培养时丧失。多数情况下得到的组织并未展现它们体内等同组织的形态特征且缺少许多特化的分化细胞类型。解决这些局限性的努力导致了其中将细胞埋入细胞外基质中生长的3D细胞培养模型的发展。该方法增强了分化的功能的表达并改善了组织组构(Pampaloni等(2007).NatRevMolCellBiol8:839-84)。特别地，在类器官培养领域已经取得了重大的最新进展。类器官是通常包含也可在人体内获得的大多数特化细胞的三维器官-芽(organ-bud)。事实上，在体外环境中模拟胚胎发育期间组织的培养和分化，使得干细胞分化成各种分化细胞。这种类器官的公知实例是小肠类器官(ShoichiDate和ToshiroSato,Mini-GutOrganoids:ReconstitutionoftheStemCellNiche,Annu.Rev.CellDev.Biol.,2015,Vol.31:269-289)。生长因子和信号传导分子如Wnt通路激动剂(如Wnt3a、R-脊椎蛋白(R-spondin)、CHIR99021)、BMP/TGF通路抑制剂(如头蛋白(Noggin))、EGF和基底膜提取物(基质胶(matrigel)或类似物)的环境的混合物(cocktail)，保证初级肠隐窝(primarygutcrypts)的培养、其干细胞生态位的维持和细胞向例如杯形细胞、肠细胞和肠内分泌细胞分化的潜能。这导致具有肠的次级形态学方面(secondarymorphologyaspects)的三维结构，包括隐窝和绒毛形成。已建立了类似的三维培养用于初级人食管、胃、结肠、肝和胰腺的培养。近期，由诱导多能干细胞生长脑类器官已取得了极大的进展。悬浮的球状体在连续振荡下的长期培养导致具有特化部分如前脑和后脑特征的所谓的迷你脑(minibrains)。甚至是最近，肾小球的培养已经实现了突破，其使用复杂的培养方案，从transwell系统上的诱导多能干细胞开始，再次产生存在于人肾的肾小球中的高度特化的细胞。这种类器官技术的缺点是缺乏对迷你器官的结构控制。特别是由于球状的形状造成缺乏独立的顶-底通道。已经尝试了将类器官方案应用于在transwell膜上建立扁平极化组织，以使得顶-底通道成为可能，但迄今为止的进展却高度受限，可能是由于细胞外基质环境对于类器官的生长是重要的，且将其引入并未产生密闭屏障。已通过在tranwell设备(setup)中的半透膜上单独地或与支持细胞(饲养层或间充质细胞如成纤维细胞)组合地培养不同来源的上皮细胞，开发了静态体外模型。不幸的是，这些模型显示低的跨上皮电阻(trans-epithelialelectricalresistance,TEER)、典型不透性标记分子的高通透性、转运蛋白(如P-糖蛋白外排泵)的低的表达和功能性，以及短期的活力。这会限制它们作为模型的价值。饲养层通常用作多种类型的胚胎干细胞和成体干细胞的培养的支持体。例如，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)通常用于支持胚胎干细胞(ESC)的培养。另一干细胞类型、即造血干细胞(HSC)的维持可以通过与基质间充质干细胞的共培养来实现和推进。典型地，饲养细胞由有丝分裂不活跃的细胞片组成并充当替代的生态位细胞，其分泌在维持所期望的目标细胞类型中重要的必要生长因子和细胞因子。饲养细胞不仅通过向培养基释放生长因子、而且还通过提供细胞外基质支持体(这促进了期望的细胞-ECM相互作用)来支持其它细胞的生长。干细胞与其微环境的相互作用调节干细胞的自我更新机制和分化能力。但是如所提到的，在Transwell设备中，不幸的是，与饲养层组合，这些模型也显示低的跨上皮电阻(TEER)、典型不透性标记分子的高通透性、转运蛋白(如P-糖蛋白外排泵)的低的表达和功能性，以及短期的活力，这会限制作为模型的价值。另外，目前的方法和手段并不允许高通量研究，例如跨上皮组织的吸收、转运和/或分泌的分析。例如，已知的transwell板不适合测定跨上皮组织样品的吸收、转运和/或分泌，这是因为组织样品不会充分地粘附至transwell板的膜。因此，需要开发其中细胞的增殖和分化模拟体内情况的培养人上皮的更明确且预测性的模型。有鉴于此，将非常期望改进的体外上皮模型的产品、组合物、方法和用途，但还尚不可用。特别地，本领域对于可靠、有效且可再现的方法存在明确的需求，所述方法允许提供此类具有独立的底-顶通道的体外上皮屏障模型，并且例如可显示也存在于体内等同组织的较特化细胞。这些模型可用于例如高通量筛选，药物吸收、转运和毒性研究，疾病建模、与例如微生物培养物的相互作用和/或研究营养摄取用模型。因此，在提供满足任何前述需求的这类产品、组合物、方法和用途中可见本专利技术所基于的技术问题。所述技术问题通过权利要求和下文中表征的实施方案来解决。附图说明图1：用于培养上皮管的装置的实例(并非按比例绘制)：底视图。图2：用于培养上皮管的装置的实例(并非按比例绘制)：观察视窗特写。图3：用于培养上皮管的装置的实例(并非按比例绘制)：图2的垂直截面。图4和5：用于培养上皮管的方法中的步骤：将包括间充质细胞的ECM凝胶前体插入图2/3的凝胶道(gellane)，固定在毛细管压力屏障上并使之胶凝化。ECM可为例如基质胶(生长因子减少或未减少的)、胶原I、胶原IV、纤维蛋白原、纤连蛋白、或其组合，以及合成ECM。图6和7：用于培养上皮管的方法中在图4/5中记述的步骤之后的步骤，其中上皮细胞引入第一灌注通道(perfusionchannel)(和任选地生长培养基引入第二灌注通道)。图8和9：用于培养上皮管的方法中在图6/7中记述的步骤之后的步骤，其中图3的装置垂直放置以使上皮细胞沉降在凝胶表面上。在上皮细胞粘附时，引入流体(未示出)。图10和11：用于培养上皮管的方法中在图8/9中记述的步骤之后的步骤，其中使上皮细胞增殖并沿通道壁和凝胶表面衬贴从而形成小管。图12和13：用于培养上皮管的方法中在图10/11中记述的步骤之后的步骤，其中使间充质细胞与上皮细胞相互作用并使上皮分化；分化可导致规则的形态学图案：这里为隐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法，所述方法包括：a)将间充质细胞引入所述微流体通道网络，其中所述间充质细胞通过以下步骤引入所述微流体通道网络，a1)使用水性介质；或a2)使用凝胶前体并使所述凝胶前体在所述微流体通道网络中胶凝化从而占据所述微流体通道网络的至少一部分；b)在步骤a1)的情况下，优选在步骤a2)的情况下，使所述间充质细胞增殖和/或分化，优选直至所述微流体通道网络的至少一部分被间充质细胞覆盖；c)将上皮细胞引入包含所述间充质细胞的所述微流体通道网络；和d)使所述上皮细胞增殖和/或分化，优选直至所述微流体通道网络的至少一部分被上皮细胞覆盖和/或直至所述间充质细胞的至少一部分被上皮细胞覆盖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.09 NL 20164041.一种使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法，所述方法包括：a)将间充质细胞引入所述微流体通道网络，其中所述间充质细胞通过以下步骤引入所述微流体通道网络，a1)使用水性介质；或a2)使用凝胶前体并使所述凝胶前体在所述微流体通道网络中胶凝化从而占据所述微流体通道网络的至少一部分；b)在步骤a1)的情况下，优选在步骤a2)的情况下，使所述间充质细胞增殖和/或分化，优选直至所述微流体通道网络的至少一部分被间充质细胞覆盖；c)将上皮细胞引入包含所述间充质细胞的所述微流体通道网络；和d)使所述上皮细胞增殖和/或分化，优选直至所述微流体通道网络的至少一部分被上皮细胞覆盖和/或直至所述间充质细胞的至少一部分被上皮细胞覆盖。2.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将凝胶前体引入所述微流体通道网络并使所述凝胶前体在所述微流体通道网络中胶凝化从而占据所述微流体通道网络的至少一部分。3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将凝胶图案化，优选通过使用毛细管压力屏障、通过UV图案化、或通过在胶凝化后将针缩回、或通过具有在胶凝化后除去的牺牲层来图案化。4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤a)中引入的所述间充质细胞分散/悬浮在所述凝胶前体中。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤a)中，使用水性介质、优选在凝胶旁边，将所述间充质细胞引入所述微流体通道网络。6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述间充质细胞增殖和/或分化，直至在所述微流体通道网络中至少形成间充质细胞的群/层/片。7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述间充质细胞增殖和/或分化，直至在所述微流体通道网络中至少形成间充质细胞的管状结构。8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞和/或所述上皮细胞在引入时解聚。9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述上皮细胞增殖和/或分化，直至在所述微流体通道网络中至少形成上皮细胞的群/层/片。10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述上皮细胞增殖和/或分化，直至在所述微流体通道网络中至少形成上皮细胞的管状结构。11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，如果在步骤a)中在凝胶中引入所述间充质细胞，则所述上皮细胞增殖和/或分化，直至上皮细胞的至少一群/层/片覆盖所述凝胶的至少一部分，所述凝胶占据所述微流体通道网络的至少一部分。12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中施加通过所述管状结构的内腔的生长培养基流，其中所述流可为单向或双向的。13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在包含因子Wnt、头蛋白、egf/fgf和/或R-脊椎蛋白的至少之一的生长培养基的存在下培养所述细胞。14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞的至少一部分位于所述微流体通道网络的壁和所述上皮细胞之间。15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述上皮细胞在由所述间充质细胞形成的管状结构的内部形成管状结构。16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，使所述上皮细胞形成具有顶侧和基底侧的细胞层，所述基底侧面向所述间充质细胞。17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞的至少一部分与所述上皮细胞的至少一部分直接接触和/或其中间充质细胞片与上皮细胞片之间的距离为基膜的厚度或小于基膜的厚度。18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞选自肌成纤维细胞、成纤维细胞、脂肪细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·沃特，D·M·库雷克，A·T·乔欧雷，S·J·特里奇，H·L·兰茨，
申请(专利权)人：米梅塔斯公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL