屏障功能测量制造技术

本发明专利技术涉及用于测量化合物对上皮细胞屏障功能的调节作用的改进的方法。所述方法允许单独或组合的试验化合物的高通量筛选。改进上皮屏障功能的化合物或负面地影响上皮屏障功能的化合物可使用本文所述的方法分析。

Barrier function measurement

The invention relates to an improved method for measuring the regulatory effect of compounds on epithelial barrier function. The method allows for high-throughput screening of test compounds alone or in combination. Compounds that improve epithelial barrier function or compounds that negatively affect epithelial barrier function can be analyzed using the methods described in this paper.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】屏障功能测量
技术介绍
上皮组织包含四种基本组织类型之一(上皮组织、结缔组织、肌肉组织、和神经组织)。上皮细胞在动物(脊椎动物和无脊椎动物两者)以及植物中发现，并且在生物体的生理中起重要作用。上皮细胞衬贴(line)在身体的腔道(cavity)和内腔(lumen)的外部和内部两者。内皮(血管、心脏、和淋巴管的内衬)和间皮(形成心包、胸膜、和腹膜的壁)是上皮的特化形式。上皮细胞形成作为内部身体的防护的上皮屏障。细胞和它们形成的屏障分隔身体的内部和外部腔道，并且为身体提供选择性吸收和分泌特定物质的手段。由于该原因，上皮屏障和上皮细胞在例如化学和营养吸收、跨细胞转运、感觉的觉察、废物排泄、和保护免受微生物感染等的多种生物过程中是重要的。所有上皮通常通过胞外纤维基底膜与下面的组织分隔开。作为实例，上皮形成肺的结构，包括肺泡或气囊，并且衬贴多数器官，例如胃和小肠、肾、和胰腺。它们还衬贴食管，并且在管和腺例如胆管和唾液腺中发现。它们形成味蕾，衬贴鼻、耳和眼以及皮肤。内皮是衬贴血管和淋巴管的内表面的内皮细胞薄层，在内腔中的循环血液或淋巴与管壁的剩余部分之间形成界面，例如血脑屏障。间皮细胞形成衬贴身体的浆液腔(serouscavity)和内部器官的特化扁平样(pavement-like)细胞单层。称为间皮的该层的主要功能是提供滑的、非粘附的、和保护性的表面。然而，间皮细胞起其他关键作用，包括跨浆膜腔(serosalcavity)的流体和细胞运输、抗原呈递、炎症和组织修复、凝血和纤维蛋白溶解以及肿瘤细胞粘附。上皮细胞由多种可区别特性表征。上皮细胞在称为上皮的组织片中结合在一起。这些片通过多种类型的相互作用保持在一起，所述相互作用包括紧密连接(tightjunction)、粘着连接(adheren)、桥粒(desmosome)、和间隙连接(gapjunction)。紧密连接起着上皮细胞的顶(上部)和基部(下部)区域之间的划定以及两个区域之间的极化的作用。上皮在基部侧(basalside)通过称为基部层(basallamina)的基部膜支撑。如所述的，一个区别特征是将极化的上皮细胞的质膜分隔为顶部和基底侧部的紧密连接的形成。细胞的顶部(apicalportion)是当例如在组织培养板上、在体外生长的细胞单层中取向时细胞的暴露部分或顶部部分(topportion)。在体内的上皮细胞片(epithelialcellsheet)的上下文中，顶面将暴露于由上皮衬贴的内腔。细胞的基底侧面由底部或基部以及侧(side)部或侧向(lateral)部构成。在组织培养板上生长的细胞的上下文中，细胞的基底侧膜是接触组织培养板的细胞部和位于紧密连接下的细胞侧部。在体内的上皮细胞片的上下文中，细胞的基底侧面将暴露于由上皮衬贴的身体的内部部分。多种蛋白质特异性地定位于顶膜或基底侧膜。鉴于重要性，上皮细胞(包括内皮细胞和间皮细胞)广泛用于研究多种生物过程并不奇怪。所述细胞非常适用于例如分子细胞生物学、(微生物)发病机制、药理学、和毒理学等领域的研究。已开发多种模型系统来研究上皮细胞和屏障功能。研究上皮细胞通常需要进入或改变与上皮细胞的顶面或基底侧面接触的培养基的能力。由于标准组织培养装置不允许这类操作，已开发特化细胞培养装置。用于多数体外模型系统的主要装置是可渗透组织培养板插入物(insert)，例如(Corning,Inc.,Lowell,Mass.)。这些装置提供可插入组织培养板的孔中的人造的可渗透生长支撑体(permeablegrowthsupport)。通过穿过可渗透生长支撑体的表面培养极化的细胞单层，所述极化的细胞单层将起到分隔组织培养孔的顶室和基底侧室的选择性屏障的作用。这类模型系统在新药物的开发、理解多种疾病、和理解试剂的毒性作用中起重要作用。例如，在药物开发过程中，在得到许可和随后的商业化之前，应表明潜在的治疗剂或药物候选物对它们的预期用途是安全且有效的。多种药物已知负调节上皮屏障功能(参见例如，Youmba等人JPediatrGastroenterolNutr2012；54:463–70)。另一方面，例如通过暂时打开屏障来调节上皮细胞的屏障功能的化合物可用于改善对体循环和对器官的药物递送(Deli,BiochimicaetBiophysicaActa–Biomembranes1788(4)2009,892–910)。同样地，暂时打开血脑屏障可用于对脑的药物递送。此外，这类系统对于理解包括在食物、化妆品、和饮料中发现的那些的各种化合物对屏障功能的作用是重要的。例如，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)毒素通过改变紧密连接蛋白的膜微区(membranemicrodomain)定位来干扰上皮屏障功能(Nusrat等人InfectImmun.2001Mar；69(3):1329-36.)，而其他组分可增加或补充上皮屏障功能。虽然目前的上皮细胞模型系统对于药物发现有用，但是由于该操作需要的高度均匀的细胞单层，在这些系统中操作细胞已证明是困难的。实验工作需要选择正确的细胞类型，产生多种均匀的细胞单层，并且确保细胞单层完整性足以进行实验。此外，所有这些应是完善确立的，从而允许实验上可接受结果的重复产生。这些困难可使开发期望的上皮细胞模型系统成为需要数月或数年工作的艰巨过程。因此，对可快速提供大量不同化合物的上皮屏障功能的数据的新的高通量筛选分析的开发存在较大兴趣。因此提供导致更好地理解化合物对上皮屏障功能的作用的改进分析是本专利技术的目标。
技术实现思路
定义在整个说明书和权利要求中使用关于本专利技术的方法、组合物、用途、和其他方面的各种术语。除非另有指明，应赋予这类术语本专利技术所属领域的普通含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式解释。虽然可在本专利技术的试验的实践中使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但本文描述优选的材料和方法。“一个/种(a,an)”和“所述(the)”：除非内容清楚地另有指明，这些单数形式术语包括复数指示物。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括两个/种以上细胞的组合等。“约(about,approximately)"：当指可测量值例如量、和持续时间等时，这些术语意为涵盖从特定值的±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、仍更优选±0.1％的变化，因为这类变化适用于进行所公开的方法。“含有”：该术语解释为是包含性的和开放的，并且不是排除性的。具体地，所述术语和其变化意为包括具体特征、步骤或组分。这些术语不应解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。“示例性”：该术语意为“作为实例、例子或说明”，并且不应解释为排除本文公开的其他配置。“微流体系统(microfluidicsystem)”：该术语指的是配置为包含、流动、处理或另外操纵例如为亚皮升至亚毫升、或毫升范围的小体积的液体的装置、或装置的流体部件。在一些实例实施方案中，微流体特征例如微流体通道的最大截面尺寸可小于1mm、小于500微米、小于100微米、小于50微米、或小于25微米。“发光探针”：该术语指的是发射光的任何探针或分子。发光的类型包括生物发光、化学发光、电化学发光、电致发光、和光致发光。探针本身可以是发光的，发光可为涉及发光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定试验化合物对上皮屏障功能的调节作用的体外方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含多个中空微流体通道的微流体系统，其中所述通道至少部分用凝胶填充；b)将上皮细胞引入所述微流体通道，并允许所述上皮细胞接触所述凝胶；c)培养引入所述微流体通道的所述上皮细胞，由此允许所述细胞在所述凝胶上形成具有顶侧和基底侧的细胞层，由此优选允许细胞在所述微流体通道中形成具有腔侧和基底外侧的管状结构；d)向所述微流体通道中的所述上皮细胞提供探针和所述试验化合物，其中所述探针和所述试验化合物独立地提供至所述顶侧、所述基底侧、或所述顶侧和所述基底侧两者；e)在各时间点测定由所述微流体通道中、或所述凝胶中、或所述微流体通道和所述凝胶两者中的所述探针提供的信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.09 NL 20151301.一种用于测定试验化合物对上皮屏障功能的调节作用的体外方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含多个中空微流体通道的微流体系统，其中所述通道至少部分用凝胶填充；b)将上皮细胞引入所述微流体通道，并允许所述上皮细胞接触所述凝胶；c)培养引入所述微流体通道的所述上皮细胞，由此允许所述细胞在所述凝胶上形成具有顶侧和基底侧的细胞层，由此优选允许细胞在所述微流体通道中形成具有腔侧和基底外侧的管状结构；d)向所述微流体通道中的所述上皮细胞提供探针和所述试验化合物，其中所述探针和所述试验化合物独立地提供至所述顶侧、所述基底侧、或所述顶侧和所述基底侧两者；e)在各时间点测定由所述微流体通道中、或所述凝胶中、或所述微流体通道和所述凝胶两者中的所述探针提供的信号。2.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤f)从步骤e)中得到的所述信号测定，从向所述上皮细胞提供所述试验化合物和/或所述探针的时间点至达到所述微流体通道中和/或所述凝胶中的荧光的预定值或值的预定变化的时间点、或者到达到所述微流体通道中和所述凝胶中的荧光之比的预定值或值的预定变化的时间点所经过的时间。3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法对多于一种浓度的所述试验化合物进行，优选其中步骤f)对多于一种浓度的所述试验化合物测定。4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中试验化合物对所述上皮屏障功能的作用在多于一个的包含培养的上皮细胞的所述微流体通道中同时测定，优选其中同时测定多于一种浓度的所述试验化合物对所述上皮屏障功能的作用。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在多个包含培养的上皮细胞的所述微流体通道的至少部分中独立地同时测定多于一种试验化合物对所述上皮屏障功能的作用。6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)之前或同时干扰所述屏障功能。7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在所述探针之前、之后或同时向所述细胞提供所述试验化合物。8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤c)中培养的细胞形成单层，优选其中所述单层基本上不允许所述探针从顶侧向基底侧和/或从顶侧向基底侧扩散。9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤e)中的两个连续时间点彼此在1秒至24小时内。10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤e)中的各时间点在10分钟-4周之间的并且包括10分钟-4周的时段内。11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述凝胶附近存在与所述凝胶接触的其他通道，其中所述通道不与包含培养的上皮细胞的所述微流体通道直接接触。12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述其他通道中存在将所述探针从所述凝胶移除的流，优选其中在步骤e)中所述凝胶中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·沃特，S·J·特里奇，H·L·兰茨，M·K·弗门，
申请(专利权)人：米梅塔斯公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL