透明皮肤试样制造技术

本发明专利技术的课题是提供透明皮肤试样。通过酶处理来除去表皮。

Transparent skin specimen

The subject of the invention is to provide transparent skin samples. The epidermis is removed by enzymatic treatment.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】透明皮肤试样
本专利技术涉及能够通过光片显微镜(lightsheetmicroscope)来观察表皮紧下方组织的透明皮肤试样、其制造方法、以及皮肤切片的处理方法。
技术介绍
作为将组织进行3维解析的技术，一直以来进行了使用了荧光显微镜的技术，但在用荧光显微镜观察组织的情况下，需要将组织包埋，通过切片机制作经切削的薄切片。这样的方法虽然适于对细胞结构等微细结构进行3维解析，但是为了观察更大的组织结构，在试样的调制和褪色等方面产生问题。为了解决这样的问题，开发出将片状的激发光从试样侧面照射，来获得光学截面的光片显微镜，对生物体试样、生物体组织等更大的试样进行3维解析成为可能。使用光片显微镜时，适于斑马鱼、鳉鱼那样的透明度高的试样，另一方面，对于哺乳动物的生物体组织、组织切片那样的不透明试样，必须进行透明化处理。近年来，开发出多种组织试样的透明化技术(专利文献1)。作为透明化技术，主要大致区分为使用了有机溶剂透明化剂的技术(非专利文献1)、和使用了水溶性透明化剂的技术(非专利文献2)，但分别在透明化的困难性、透明化试样的折射率、抗原性的维持方面具有课题。此外，在将人组织透明化的情况下，已知人组织中基质丰富，光散射性高，难以透明化。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2014-5231号公报非专利文献非专利文献1：Cell(2014)vol.159,Issue4,pp.896-910非专利文献2：NatureNeuroScience(2015),vol.18,No.10,pp1518-1529非专利文献3：Cell(2014)vol.157,Issue3,pp.726-39非专利文献4：ProceedingsoftheIEEEConferenceonComputerVisionandPatternRecognitionWorkshops:29-37
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术人等尝试了人皮肤切片的透明化，结果发现下述课题：除了皮肤中的基质丰富存在所带来的透明化的困难性以外，还不能观察被透明化的皮肤试样的表皮紧下方。用于解决课题的方法因此，本专利技术人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现表皮部分的透明化不充分(图1)。对从皮肤切片仅去除表皮部分的方法进行了研究，结果发现通过采用分散酶溶液的处理来除去表皮部分从而能够观察表皮紧下方的毛细血管结构，完成了本专利技术。具体而言，本专利技术涉及一种透明皮肤试样，是能够通过光片显微镜来观察表皮紧下方组织的透明皮肤试样，其不伴有表皮，并维持了抗原性。在其它的方案中，本专利技术也涉及从取得的皮肤切片制造透明皮肤试样的方法、和通过该制造方法制造的透明皮肤试样。在进一步其它的方案中，本专利技术也涉及皮肤切片处理方法、和通过光片显微镜观察通过该处理方法进行了处理的皮肤试样的方法。专利技术的效果通过使用本专利技术的透明皮肤试样，能够观察表皮紧下方的结构。附图说明图1是对不进行表皮除去处理，进行透明化处理而取得的人皮肤试样，使用抗CD31抗体作为一抗，使用AlexaFluoro594标记抗羊IgG抗体作为二抗，通过光片显微镜取得的三维图像。可以理解表皮紧下方的区域的结构不能可视化。图2中图2(A)是不进行表皮除去处理，进行透明化处理而取得的透明的人皮肤试样切片的照片。在表皮侧残留不透明的层。图2(B)是进行表皮除去处理，接着进行透明化处理而取得的透明的人皮肤试样切片的照片。图3是对进行表皮除去处理，接着进行透明化处理而取得的人皮肤试样，使用抗CD31抗体作为一抗，使用AlexaFluoro594标记抗羊IgG抗体作为二抗，通过光片显微镜取得的三维图像。表皮紧下方的毛细血管的结构可以可视化。图3(A)是关于从人的背部取得的皮肤切片的图像，图3(B)是关于从人的面部取得的皮肤切片的图像。在背部，毛细血管采用环(loop)结构，另一方面，在面部，毛细血管采用随机结构，这方面是不同的。图4是对进行表皮除去处理，接着进行透明化处理而取得的人皮肤试样，使用抗CD31抗体与Cy3标记抗αSMA抗体作为一抗，使用AlexaFluoro488标记抗羊IgG抗体作为二抗，通过光片显微镜取得的三维图像。图4(A)是关于从人的背部取得的皮肤切片的图像，图4(B)是关于从人的面部取得的皮肤切片的图像。α-SMA是在平滑肌中被表达的蛋白质，CD31是在血管内皮细胞被表达的蛋白质。由图4A和B，显示出包围血管内皮细胞的平滑肌，在背部与面部的皮肤中，毛细血管的结构不同。背部的皮肤从上方观察毛细血管时往往看起来像点，另一方面，面部的皮肤的毛细血管即使从上方观察也看起来像形成网状。即，对于背部的皮肤，可以认为环状的毛细血管向上延伸，另一方面，面部的皮肤的毛细血管沿横向扩展，在这方面是不同的。图5是关于进行表皮除去处理，并使用各种透明化处理方法进行了透明化的人皮肤试样，显示透明度的图。图6中图6A是进行表皮除去处理，并使用各种透明化处理方法进行了透明化的人皮肤试样的照片。图6B是表示在各种透明化处理方法中进行了透明化的皮肤试样中的雾度率的图。图7是关于眼梢的皮肤、皮下脂肪组织、和轮状肌肉成为一体的皮肤样品，分别显示CD31、与LYVE1、脂滴包被蛋白(Perilipin)、或抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的共标记图像。图8是关于年轻的被检人群、与老龄的被检人群的面颊、眼梢和背部来源的进行了表皮除去的皮肤试样，将血管用CD31抗体可视化了的图像。图9是测定被可视化的血管的体积、直径和分支数，在年轻的被检人群、与老龄的被检人群中进行了比较的图。具体实施方式本专利技术涉及一种透明皮肤试样，是能够通过光片显微镜来观察表皮紧下方组织的透明皮肤试样，其不伴有表皮，并维持了抗原性。在本专利技术中，皮肤试样可以为由任意动物种取得的皮肤试样，也可以为通过三维培养技术而培养的培养皮肤组织。作为动物种，可举出任意的哺乳动物，例如人、猪、马、牛、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、猴、黑猩猩等，不限定于此。从有益于美容的观点考虑，皮肤试样优选由人取得。皮肤试样的取得位置可以为任意位置，可举出例如脸部、腕部、腹部、臀部等。此外，从对存在暗沉、肌肤粗糙、斑、皱纹、皮肤炎等皮肤问题的皮肤区域中的结构进行解析的观点考虑，可以从存在皮肤问题的皮肤区域取得皮肤试样。所谓“透明”，只要是能够通过光片显微镜观察的透明度，就可以为任意透明度。从能够通过光片显微镜观察的观点考虑，所谓透明，是指波长380nm～780nm的光线可以透射，优选为波长450nm～750nm，更优选为波长490nm～650nm的光线可以透射。“能够通过光片显微镜来观察表皮紧下方组织的透明”皮肤试样并不意图为仅供于光片显微镜的试样，只要是具有上述透明性的皮肤试样，当然也能够用通常的荧光显微镜、共聚焦显微镜等观察。透明性可以通过任意指标来确定，例如可以使用下述式子所示的平行光线透射率。Tp＝(Tt-(1-s1)×α)/s1-Td/s1{式中，Td为扩散透射率，Tt为全光线透射率，s1为皮肤组织的面积率，α为盖玻片的全光线透射率(0.77)，Tp为皮肤组织的平行光线透射率}在计算上述平行光线透射率的情况下，为10％～100％。关于扩散透射率、全光线透射率、和平行光线透射率，可以通过使用雾度计(Hazemeter)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种透明皮肤试样，是能够通过光片显微镜观察表皮紧下方组织的透明皮肤试样，其不伴有光不透射性的表皮，并维持了抗原性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.10 JP 2016-1578731.一种透明皮肤试样，是能够通过光片显微镜观察表皮紧下方组织的透明皮肤试样，其不伴有光不透射性的表皮，并维持了抗原性。2.根据权利要求1所述的透明皮肤试样，在测定了以下式子所示的透明度的情况下，透明皮肤试样的平行光线透射率为10％～100％，Tp＝(Tt-(1-s1)×α)/s1-Td/s1式中，Td为扩散透射率，Tt为全光线透射率，s1为皮肤组织的面积率，α为盖玻片的全光线透射率即0.77，Tp为皮肤组织的平行光线透射率。3.根据权利要求1或2所述的透明皮肤试样，所述透明皮肤试样来源于人。4.一种由取得的皮肤切片制造透明皮肤试样的方法，其包含下述工序：使该皮肤切片与表皮除去用的酶溶液接触的工序，使该皮肤切片与固定溶液接触而固定的工序，使该皮肤切片与透明化试剂接触的工序。5.根据权利要求4所述的方法，在所述固定工序之后，进一步包含下述工序：使所述皮肤切片与标记抗体溶液接触的工序。6.根据权利要求4或5所述的方法，所述皮肤试样来源于人。7.根据权利要求4～6中任一项所述的方法，所述酶溶液为分散酶溶液。8.根据权利要求4～7中任一项所述的方法，所述固定溶液为低聚甲醛溶液。9.根据权利要求4～8中任一项所述的方法，所述透明化试剂包含有机溶剂系透明化试剂。10.根据权利要求9所述的方法，所述有机溶剂系透明试剂包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：加治屋健太朗，山下丰信，
申请(专利权)人：株式会社资生堂，
类型：发明
国别省市：日本,JP