用于体外调节细胞培养物的化学微环境的组合物、装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及组合物，该组合物包含含有能够在培养环境下重新创建体内存在的细胞微环境的功能性酶的聚合物基质或凝胶。本发明专利技术还涉及用于包含此类组合物(特别是水凝胶)的细胞培养物的装置，以及其用于调节细胞培养物的化学微环境或模拟体内细胞的生理或病理环境的用途。该组合物和本文所述的装置也可以用于在体外评估化合物对确定的细胞系或原代细胞的治疗性效果。

Compositions, devices and methods for in vitro regulation of the chemical microenvironment of cell cultures

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体外调节细胞培养物的化学微环境的组合物、装置和方法
本专利技术涉及包含基质的组合物，该基质含有能够在培养环境下重新创建体内存在的细胞微环境的功能性酶。本专利技术还涉及用于包含此类组合物(特别是水凝胶组合物)的细胞培养物的装置，还涉及其用于调节细胞培养物的化学微环境或模拟体内细胞的生理或病理环境的用途。该组合物和本文所述的装置也可以用于在体外评估化合物对确定的细胞系或原代细胞的治疗性效果。
技术介绍
氧水平和机械性能是细胞生长的基本参数，这些参数调节属于细胞的所有功能和决策。需要在体外细胞培养物中完美地调节这类性能。通常用20％氧气进行体外细胞培养，该氧气浓度并不是体内组织中存在的氧气浓度，其相当于根据组织和环境的约5％。葡萄糖梯度、氧梯度和pH梯度在细胞培养物和关键解剖区域(如干细胞小生境、实体瘤瘤块、衰老组织)的典型环境之间具有相当大的差异。现有技术中没有公开这种装置，该装置以简单、廉价且可调节的方式重新创建组织和体内细胞环境中存在的主要生理环境(最初的氧梯度、葡萄糖和pH)，这些条件在常规的体外培养技术下是无法获得的，除非使用方法复杂且成本高昂的特定仪器(例如低氧性通风橱)。在生理环境下，氧气的分压相对于所涉及的器官或组织在24和160mmHg之间变化。相反，在病理环境下，特别是在肿瘤环境下，组织内的氧含量急剧下降，或者在最急剧的情况下为零，将这两种情况分别定义为低氧和缺氧，它们与生理学上的同义词-常氧条件区分开。这种强烈下降的两个主要原因是：血管广泛破坏而无法维持将足够的氧气输入组织，和频繁形成对器官有害的血红蛋白中间体(如羧基血红蛋白和高铁血红蛋白)；在这种情况下，分压在从细胞内细胞色素周围的0.02mmHg到与毛细血管中氧水平相关的45mmHg的范围。在生理和病理两种环境下的体外培养环境和体内真实环境之间的差异代表了所有临床前实验、药物发掘过程、疾病研究、再生医学、药物实验和个体化治疗中存在的难题。专利申请US2015362483描述了用于体外模拟体内病理和生理细胞环境的方法。该方法需要具有机械组件的装置，昂贵且难以管理，该装置显然不能在通常用于细胞生长的培养板水平上重复。对细胞外基质中的代谢物和可溶性分子的浓度和梯度的测微检查达不到再现生理环境的要求。因此，对于该难题需要提供用于在体外有效地模拟生理性或病理性细胞环境的新的方法、组合物和装置，而它们没有表现出现有技术中所记载技术方案的缺点。
技术实现思路
本专利技术基于采用包含基质的组合物，该组合物特别是以水凝胶的形式，该基质含有能够在培养环境下重新创建在体内存在的细胞微环境的功能性酶。本专利技术的作者不仅已经表明可以通过本文所述的组合物和水凝胶来调节细胞培养环境，而且还表明成功创造的环境与组织(正常组织和肿瘤组织两者)中存在的那些环境相似。本专利技术的结果是有利的，因为使用包含组合物和水凝胶的装置允许在体外再现特定的生理环境并进行细胞代谢相关的研究，例如环境对健康细胞和肿瘤细胞两者的代谢、细胞信号传导、基因表达的影响；此外，它允许评估肿瘤生长因子，并且基于此设计更加有效的治疗性策略。根据本专利技术的装置代表了用于临床前研究的独特系统，如同体内系统一样可靠，并具有体外系统的所有优点。在评估其开发为新的治疗性策略的潜力的新药实验中，本专利技术装置的应用可以具有在真实肿瘤微生理环境中开展该新药实验的优势。此外，利用计算机方法，可以通过考虑人体组织中天然存在的浓度梯度来开发药物递送的新策略，并在这些仿生系统中测试它们。首先，本专利技术涉及用于体外细胞培养物的组合物，其具有以下特征：它们包含基质，特别是聚合物或蛋白质基质，该基质含有一种或多种能够催化氧还原的酶，以调节在所述细胞培养物中的氧梯度。其次，本专利技术涉及用于在体外培养细胞的装置，该装置包括用于细胞的容器和根据本文所述实施方式中任一项的组合物。另外，本专利技术涉及用于模拟体内细胞的生理或病理环境的体外方法，其具有以下特征：在用于细胞的容器中培养细胞系(或原代细胞)的步骤，其中已经将根据本文所述实施方式中任一项的组合物或水凝胶沉积在该容器中。另外，本专利技术涉及用于调节细胞培养物的化学微环境的方法，其具有以下特征：在用于细胞的容器中培养细胞系(或原代细胞)的步骤，在该容器中已经沉积了根据本文所述实施方式中任一项的组合物。另外，本专利技术涉及用于评估药物或化合物对确定的生理或病理环境的影响的方法，其包括：在用于细胞的容器中培养细胞系的步骤，其中已经将根据本文所述实施方式中任一项的组合物沉积在该容器中，和将所述药物或化合物添加至所述细胞系的步骤。另外，本专利技术涉及用于制备以水凝胶形式的组合物的方法，包括以下步骤：a)制备包含一种或多种易于催化氧还原的酶的溶液；b)添加交联助剂；c)将溶液凝胶化。附图说明图1：图1示意性地示出了根据本专利技术的装置的操作。图2：由活性基质的网格改良以重新创建肿瘤微环境的培养板的原型的照片。图3：细胞MCF10A和MCF7在对照平板和用非活性(不含酶)蛋白质基质改良的平板上的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。图4.以位于与产生低氧的活性凝胶相距几十微米的UME(Pt10μm)记录的电流分析，对于PBS，E＝-0.7VvsAg/AgCl。在约4秒时，加入浓度为1mM的葡萄糖。图5.以UME在活性基质条带(用于产生缺氧)上得到的扫描曲线，方向垂直于活性条带，并且电极保持在与其上放置有活性基质的平板相距恒定高度处。对于1mM葡萄糖的PBS溶液，E＝-0.7VvsAg/AgCl(3MKCl)。图6.UME(Pt10μm)在用以彼此相距1-1.5mm放置的活性基质条带改良的平板上得到的扫描曲线。对于1mM葡萄糖的PBS溶液，E＝-0.7VvsAg/AgCl(3MKCl)。图7.在存在1mM葡萄糖的PBS溶液、电位＝-0.6V、最大速度为50μm/s、PtUME10μm和参比电极Ag/AgCl(3MKCl)下进行的凝胶附近的接近曲线。图8：通过采用赤藓红B针对对照平板和用非活性(仅BSA)和活性(含有Gox和CAT)蛋白质基质改良的平板上的细胞MCF10A的活力的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。此外，突出了对活性平板中存在的化学梯度的生长的影响。图9：通过采用赤藓红B针对对照平板和用非活性(仅BSA)和活性(含有Gox和CAT)蛋白质基质改良的平板上的细胞MCF10A的活力的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。此外，突出了对活性平板中存在的化学梯度的生长的影响。图10.在含有酶的活性水凝胶(左侧)的存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。图11.在非活性水凝胶(左侧)的存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。图12.取决于细胞MCF10A与水凝胶的距离的细胞生长密度，将酶存在下的凝胶和对照凝胶相比较。细胞密度的过程在对照平板中是均匀的，与存在梯度的那些相反，其中观察到在低氧区域附近是低密度区域。图13.在非活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。图14.在非活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。图15.取决于细胞MCF10A与水凝胶的距离的细胞生长密度，将酶存在下的凝胶与对照凝胶进行汇合度比较。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在体外细胞培养物中使用的组合物，所述组合物包含基质，其特征在于，所述基质包含一种或多种能够催化氧还原的酶，以调节在所述细胞培养物中的氧梯度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.04 IT 1020160000993801.一种用于在体外细胞培养物中使用的组合物，所述组合物包含基质，其特征在于，所述基质包含一种或多种能够催化氧还原的酶，以调节在所述细胞培养物中的氧梯度。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述基质是聚合物或蛋白质基质。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述酶选自葡萄糖氧化酶(GOx)、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、乳酸氧化酶、细胞色素氧化酶或漆酶。4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，还包含过氧化氢酶。5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中通过交联助剂(交联剂)将所述酶与所述基质共价结合。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述交联助剂选自戊二醛(GDA)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯、N-羟基琥珀酰亚胺、甲醛、光反应剂。7.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中通过机械和/或静电相互作用将所述酶捕获在聚合物基质中。8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是水凝胶。9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶选自硅酮水凝胶、聚丙烯酰胺、纤维素、纤维素衍生物、胶原、羧甲基纤维素、藻酸盐、壳聚糖、琼脂、polimacon、透明质酸、聚甲基丙烯酸甲酯、水凝胶肽-模拟物。10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述水凝胶的所述基质还包含牛血清白蛋白(BSA)。11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述水凝胶的所述聚合物基质包含与戊二醛共价结合的葡萄糖氧化酶(GOx)、过氧化氢酶和牛血清白蛋白(BSA)或由与戊二醛共价结合的葡萄糖氧化酶(GOx)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯特凡尼娅·拉皮诺，弗朗切斯科·泽贝托，盖斯顿·卡斯特拉尼，斯蒂法诺·萨尔维奥利，比阿特丽斯·法博尼，伊莎贝拉·兹罗尼，玛丽亚·孔特，克劳迪·弗兰切斯基，丹妮拉·萨尔瓦多，麦拉·白克妮，
申请(专利权)人：博洛尼亚大学，
类型：发明
国别省市：意大利,IT