血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，属于试剂盒技术领域。解决了现有的检测血管内皮生长因子的方法操作繁琐、检测时间长、自动化程度低、受人为因素影响大、灵敏度低、重复性差的问题。本发明专利技术的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；R1试剂包含链霉亲和素磁颗粒和缓冲液Ⅰ；R2试剂包括化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体和缓冲液Ⅱ；R3试剂包括偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体和缓冲液Ⅲ。该试剂盒操作简单、检测时间短、自动化程度高、不受人为因素影响、灵敏度高、重复性好、抗干扰性好、检测范围宽、热稳定性好。

Chemiluminescence Immunoassay Kit for Vascular Endothelial Growth Factor and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
本专利技术属于试剂盒
，具体涉及一种血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
血管内皮生长因子(VEGF)是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，有两个相同亚单位通过二硫键结合形成，等电点为8.5，具有很强的耐热和耐酸能力。人VEGF基因有5种不同的异构体，分别为VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145和VEGF121。位于血管内皮细胞上的3种VEGF受体(VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)是VEGF的高亲和力结合位点，这三种受体均是跨膜受体。研究表明VEGF受体在体外与VEGF有高度亲和力。VEGF是调节新血管生成的最重要的细胞因子。研究表明VEGF在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用。在人类各种恶性肿瘤疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性。有大量文献报道，与正常人相比，癌症患者血液中VEGF浓度显著升高。因此，检测人血液中的VEGF浓度，能够用于癌症的早期普查诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF的血液浓度就高；而当肿瘤因化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。因此VEGF的检测可作为疗效观察和预后的指标。VEGF是恶性肿瘤诊断中的一个重要组成部分。另外，血液VEGF水平增高亦见于糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。化学发光免疫测定(CLIA)是继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术和时间分辨荧光免疫技术之后发展的一项新兴免疫测定技术。由于它既具有免疫反应的高度特异性，又具有发光反应的高敏感性，近年来已被国内外临床实验室及科研单位广泛应用于各种激素、特种蛋白及药物的监测和分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、试剂稳定性好、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验分析手段。常见的化学发光体系有多种，最主要的有：HRP-鲁米诺系统、吖啶酯系统、电化学发光体系等。吖啶酯发光体系相对于其他体系而言具有其特殊的优点：首先吖啶酯标记工艺简单，标记物发光稳定，试剂盒有效期长，成本相对较低；且发光为闪光型，发光快速集中且强大，方便实现快速检测，检测的灵敏度和精密度都很高，对于仪器的要求简单，便于实现全自动化操作；其次，吖啶酯发光系统较为简单，碱性-过氧化氢就可以直接发光，不需要增强剂或者催化剂，干扰因素少，本底极低，信噪比很高。目前我国获准上市的临床检测血管内皮生长因子试剂盒检测原理主要以酶联免疫法(ELISA)和辣根过氧化物酶联合鲁米诺类化合物化学发光。但是，现有的酶联免疫法不仅操作繁琐，自动化程度低，受人为因素影响大，不利于在基层医院推及，而且特异性及灵敏性都有待提高。基于以上情况，研制开发高特异性、高灵敏度的吖啶酯类血管内皮生长因子化学发光免疫分析试剂盒，用于肿瘤的广谱筛查、辅助诊断、预后检测，从理论与实际意义上讲是切实可行，并有广泛市场前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有的检测血管内皮生长因子的方法操作繁琐、检测时间长、自动化程度低、受人为因素影响大、灵敏度低、重复性差的问题，而提供一种血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。本专利技术解决上述技术问题采取的技术方案如下。本专利技术首先提供一种血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；所述R1试剂包括链霉亲和素磁颗粒和缓冲液Ⅰ；所述R2试剂包括化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体和缓冲液Ⅱ；所述R3试剂包括偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体和缓冲液Ⅲ。优选的是，优选R1试剂中链霉亲和素磁颗粒的质量百分浓度为0.01％～1％，更优选的为0.05％～0.072％。优选的是，优选R2试剂中化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体的浓度为≥0.1μg/mL，更优选的0.1～1.0μg/mL。优选的是，优选R3试剂中偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/ml，更优选的0.7～2.0μg/ml。优选的是，所述链霉亲和素磁颗粒的粒径为0.05～3μm。优选的是，所述化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体中，血管内皮生长因子单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:(1～20)，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。优选的是，所述偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体中，血管内皮生长因子单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:(1～20)，所述偶联标记物为生物素。优选的是，所述缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ和缓冲液Ⅲ均为含有0.05％～0.1％的表面活性剂、0.01％～0.1％的防腐剂和50-400mM的缓冲盐的pH为6.0-7.2的缓冲液。优选的是，所述的试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；A液为过氧化氢溶液和硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液。优选的是，所述的试剂盒还包括血管内皮生长因子校准品，校准品包括浓度分别为0.00ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL的血管内皮生长因子的溶液。本专利技术还提供上述的血管内皮生长因子的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：步骤一、将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，以缓冲液Ⅰ清洗后在缓冲液Ⅰ中配成固相试剂，即为R1试剂；步骤二、将血管内皮生长因子单克隆抗体放入离心管中离心，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，将封闭好的抗体经过纯化、收集，用缓冲液Ⅱ稀释，得到R2试剂；步骤三、将血管内皮生长因子单克隆抗体放入离心管中离心，然后加入TRIS缓冲液，混匀后加入偶联标记物溶液离心，反应后，加入赖氨酸，继续反应，最后将反应液用脱盐柱纯化、收集后，用缓冲液Ⅲ稀释，得到R3试剂。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术的血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，以链霉亲和素磁颗粒作为固相载体，结合发光强度和灵敏度都较高的化学发光物质对VEGF进行标记，采用过氧化氢化学发光体系，以双抗体夹心法实现对VEGF的定量检测，操作简单、检测时间短、自动化程度高、不受人为因素影响、灵敏度高、重复性好、抗干扰性好、检测范围宽、热稳定好。具体来讲：1、本专利技术的链霉亲和素磁珠化学发光免疫检测试剂盒采用链霉亲和素磁颗粒与生物素标记的抗体可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强；2、本专利技术的血管内皮生长因子化学发光免疫测定试剂盒选择吖啶酯等为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料由激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本，且吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽。3、本专利技术的血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守，缩短了临床检测所需的时间，同时检测精度较高，试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。4、本专利技术的血管内皮生长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；所述R1试剂包括链霉亲和素磁颗粒和缓冲液Ⅰ；所述R2试剂包括化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体和缓冲液Ⅱ；所述R3试剂包括偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体和缓冲液Ⅲ。

【技术特征摘要】
1.血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；所述R1试剂包括链霉亲和素磁颗粒和缓冲液Ⅰ；所述R2试剂包括化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体和缓冲液Ⅱ；所述R3试剂包括偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体和缓冲液Ⅲ。2.根据权利要求1所述的血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中链霉亲和素磁颗粒的质量百分浓度为0.01％～1％；所述R2试剂中化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体的浓度为≥0.1μg/mL；所述R3试剂中偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/ml。3.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中链霉亲和素磁颗粒的质量百分浓度为0.05％～0.072％；所述R2试剂中化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体的浓度为0.1～1.0μg/mL；所述R3试剂中偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体的浓度为0.7～2.0μg/ml。4.根据权利要求1所述的血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁颗粒的粒径为0.05～3μm。5.根据权利要求1所述的血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体中，血管内皮生长因子单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:(1～20)，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。6.根据权利要求1所述的血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记物标记的血管内皮生长因子单克隆抗体中，血管内皮生长因子单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李磊，李冬梅，孙成艳，高威，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22