一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。本发明专利技术采用多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与抗躁狂药物用药相关的GSK3B和NTRK2基因上2个单核苷酸多态性(SNP)位点。检测步骤：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离2个SNP位点、3个人类基因组DNA内参基因及1个PCR反应内参的PCR产物；(4)结果分析判读。本发明专利技术的优势是快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低。

A Multiplex Gene Detection Kit for Antimanic Drug Guidance and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及一种多重基因检测试剂盒，具体涉及一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
躁狂症是一种情感性精神障碍疾病，该病的基本特征为患者思维奔逸、情绪高涨、言语动作较平常增多，主要的临床表现是易激惹以及情绪高涨。躁狂症往往兼有抑郁发作，因此躁狂症已被列为双相情感障碍的一种。大多数躁狂症患者会呈现反复发作，严重患者还会伴随幻觉、妄想等精神病性症状。药物治疗是治疗躁狂症的主要方法。随着对躁狂症发病生理机制逐渐被揭示，抗躁狂症类药物的开发也取得的飞速的发展。临床上常使用心情稳定剂联合其他药物治疗躁狂症。心境稳定剂包括锂盐、卡马西平和丙戊酸盐。锂盐是最主要的抗躁狂药物，但其治疗窗窄，药物过量会导致严重不良反应，而药量过低又会使治疗效果不佳。研究表明，GSK3B基因多态性影响锂盐的代谢，NTRK2基因多态性影响丙戊酸盐的治疗效果，应根据患者基因型适当调整药物剂量。人类基因组80％以上基因多态性都是单核苷酸多态性(SingleNucleotidepolymorphism，SNP)。SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、缺失和插入。与药物相关的基因SNP位点发生突变可使对应的酶活性发生变化，从而影响药物代谢、转运或靶点结合，导致药物疗效不佳，甚至发生严重毒副反应。因此，通过对抗躁狂用药相关的SNP位点进行检测，为患者量身定制一套用药方案，可提高治疗效率，减轻躁狂症患者的医疗负担和痛苦，节省大量医院及社会资源(见表1)。表1抗躁狂药物用药指导相关基因目前市场上，SNP分型检测技术主要有三种：测序法、荧光定量PCR法、基因芯片法：(1)荧光定量PCR法荧光定量PCR采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针，具有灵敏度高、准确性高和特异性高等优势。但荧光定量PCR通量低，若要同时检测多个个SNP位点，需要分管检测，操作复杂，样品用量大，难以适应临床需求。此外，荧光定量PCR难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性。(2)基因芯片法基因芯片是通过微加工技术，将数以万计的特定序列的DNA片段(基因探针)有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。(3)测序法Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能检测已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂，成本较高。当测序位点较多时需要逐个位点测序，耗时长，累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势，然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术在临床上的应用还不够成熟。由于与抗躁狂药物用药相关的基因SNP数量较多，以上技术均具有明显局限性，因此很难应用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测。目前，国内尚无有关以多重PCR和CE分离技术为基础的抗躁狂药物用药指导的多重基因检测方案的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速、灵敏度高、重复性好、准确性高、特异性强、通量高、成本低的抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。其特征在于，使用多重PCR结合片段长短/质量分析方法，在一个反应管中同步快速定性检测与抗躁狂药物用药相关的2个单核苷酸多态性(SNP)位点。本试剂盒在检测上述2个SNP位点的PCR反应系统中加入了3个人基因组DNA(huDNA)内参和1个PCR反应内参(如表2所示)，同步进行PCR扩增，用于监测核酸提取及PCR反应过程，可避免假阴性和假阳性。表2抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒检测位点和引物本试剂盒包括以下组分：引物组合物ManiaPrimerMix、PCR反应液和阳性对照品、超纯水。阳性对照品包含上述2个SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物，用于SNP检测系统测试及每次引物订购后的质量控制。PCR反应液包括以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。使用本试剂盒检测步骤如下：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸。其中，保存于细胞采集卡上的口腔脱落细胞，可不需进行核酸提取，直接用于PCR扩增，节省了核酸提取的时间；(2以细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增。PCR反应条件为：95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃30s，循环29次；60℃，15min；4℃直至收取PCR产物；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离2个SNP位点及4个内参。本专利技术采用毛细电泳分离PCR产物：在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.7μL，标准品SIZE-5000.3μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细电泳；(4)根据所设计的每个检测位点的片段长度进行结果分析。根据检测峰图，可获得每个SNP位点的基因型，结合各个基因对应的临床参考信息(表3.1～3.2)，指导抗躁狂药物的个性化使用。表3.1GSK3B基因对应的临床参考信息表3.2NTRK2基因对应的临床参考信息与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：本专利技术基于3500基因分析仪创立了一种用同步检测与抗躁狂药物用药相关的2个基因上2个SNP位点的检测方案；特异性和准确度可达到qPCR水平；可在短时间内(2.5小时)同时完成多个样品2个SNP位点的检测；DNA内参和反应内参的使用可监测DNA提取及PCR反应的效率，避免了假阴性和假阳性。综上所述，本专利技术提供了一种同步检测与抗躁狂药物用药相关的2个基因上2个SNP位点的检测方案，具有快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低等优势。附图说明图1为一个躁狂症患者的口腔脱落细胞采集卡样本(未经核酸提取，直接进行PCR)的检测结果；图2为一个躁狂症患者的全血样本的检测结果。具体实施方式为了更好地理解本专利技术的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本专利技术进一步说明，而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术的内容后，该领域的技术人员对本专利技术作出一些非本质的改动或调整，仍属于本专利技术的保护范围。实施例1和2所述引物组合物ManiaPrimerMix为表2所述用于扩增2个SNP位点的各3条引物和4个内参基因的各2条引物：SEQIDNO.1～SEQIDNO.14。实施例1和2所述PCR反应液包括以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTP。实施例1和2所述阳性对照品ManiaPOS为表2所述内含2个SNP位点和4个内参基因所对应的质粒混合物。实施例1本实施例采集一个躁狂症患者的口腔脱落细胞，以细胞采集卡为模板直接进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：1.生产用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒，包括以下组分：1)引物组合物ManiaPrimerMix；2)PCR反应液；3)阳性对照品ManiaPOS；4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括如下表所示的同步快速定性检测与抗躁狂药物用药相关的2个SNP位点和4个内参基因的引物组合物：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14、PCR反应液、阳性对照品和超纯水；所述2个SNP位点为：GSK3B基因的rs334558位点，NTRK2基因的rs2769605位点；

【技术特征摘要】
1.一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括如下表所示的同步快速定性检测与抗躁狂药物用药相关的2个SNP位点和4个内参基因的引物组合物：SEQIDNO.1～SEQIDNO.14、PCR反应液、阳性对照品和超纯水；所述2个SNP位点为：GSK3B基因的rs334558位点，NTRK2基因的rs2769605位点；2.如权利要求1所述的一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，针对所述2个SNP位点中的每一个SNP位点设计了3条引物，其中野生型引物和突变型引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物分别与野生型和突变型引物形成引物对，扩增出片段长度有2～10个碱基差异的PCR产物。3.如权利要求1所述的一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，在多重PCR反应中加入3个人基因组DNA内参和一个PCR反应内参。4.如权利要求1所述的一种用于抗躁狂药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括所述2个SN...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕军英，王凡，吴勇，余丁，
申请(专利权)人：宁波海尔施基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33