本发明专利技术公开了一种华法林药物相关基因基因多态性检测的引物组、试剂盒及检测方法，能够用于快速、灵敏、有效的检测华法林药物相关基因(CYP2C9、VKORC1)基因多态性的引物组，并利用这些引物开发出用于检测华法林药物相关基因(CYP2C9、VKORC1)基因多态性的方法和试剂盒。本发明专利技术公开的引物组、试剂盒及检测方法具有灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确等特点。
A primer group, kit and detection method for warfarin-related gene polymorphism detection
【技术实现步骤摘要】
一种华法林药物相关基因基因多态性检测的引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物技术及医学领域，更具体地，涉及一种华法林药物相关基因基因多态性检测的引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
华法林是一种香豆素类口服抗凝血药物，治疗窗窄，剂量个体差异大，容易发生出血或栓塞等不良反应。研究发现，CYP2C9和VKORC1基因多态性显著影响华法林用药剂量。CYP2C9基因位于染色体区10q24.2上，全长约为55kb，含有8个内含子，9个外显子(mRNA长1.47kb)，编码490个氨基酸残基的蛋白质。现已发现CYP2C9*1～CYP2C9*30共30个等位基因。华法林的主要活性异构体S-华法林在体内是由CYP2C9代谢的，其中，CYP2C9*2和*3单核苷酸突变能减弱该酶的活性，使其对华法林的代谢能力显著降低，所需的华法林剂量也相应减少，这一点已经得到了证实。亚洲人群出现这两种突变的频率较小，所以CYP2C9基因多态性仅能部分解释个体间华法林剂量的差异。CYP2C9对华法林剂量的影响在不同的研究中比重有差异。总体而言，CYP2C9基因多态性可解释约12％(范围4％～20％)华法林剂量差异。在中国人群中，研究显示CYP2C9*3可解释约20％的华法林剂量的差异。CYP2C酶家族其他基因，如CYP2C18、CYP2C19也会影响华法林剂量，其中CYP2C18可解释0.4％剂量个体差异。VKORC1是华法林的作用靶点，遗传变异(主要为单核苷酸多态性)可影响VKORC1的转录水平，进而影响华法林药效动力学过程，是导致华法林剂量差异最主要的原因。研究表明，VKORC1基因多态性与华法林稳定剂量个体差异具有统计学相关性。总体而言，VKORC1基因多态性可解释27％(范围15％～40％)华法林剂量差异。研究发现，GA和GG基因型患者，VKORC1启动子活性较高，VKORC1mRNA表达增加，导致VKORC活性增高，从而需要更高剂量华法林。关于基因突变检测方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究。己经报道的方法包括直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、ScorpionsARMS、TaqManPCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplificationrefractorymutationsystem,扩增阻滞突变系统)法。直接测序法检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列的步骤，费时费力，但是该方法的优点是能够发现一些新的未知突变。ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特异性的识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。目前，市场上相关试剂盒包括QIAGEN公司和厦门艾德公司，价格昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种华法林药物相关基因基因多态性检测的引物组、试剂盒及检测方法，釆用ARMS技术与SYBR染料相结合的方法，该方法灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确，且检测成本大大降低。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种华法林药物相关基因基因多态性检测的引物组，其特征在于，包括CYP2C9(8633)基因多态性的检测引物5′-AGAGGAGCATTGAGGAAC-3′SEQIDNO:15′-AAGAGGAGCATTGAGGACT-3′SEQIDNO:25′-TAACAACCAGGACTCAT-3′SEQIDNO:3CYP2C9(47639)基因多态性的检测引物5′-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3′SEQIDNO:45′-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3′SEQIDNO:55′-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3′SEQIDNO:6VKORC1(3588)基因多态性的检测引物5′-AGGCGTGAGCCACCGCACAC-3′SEQIDNO:75′-GCGTGAGCCACCGCACAT-3′SEQIDNO:85′-TAACAACCAGGACTCAT-3′SEQIDNO:9内参的检测引物5′-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'SEQIDNO:105'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'SEQIDNO:11。一种华法林药物相关基因基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，包括如前述的引物组、PCR缓冲液、阳性对照液和阴性对照液。优选地，所述PCR缓冲液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶、1.0-5.0mM的MgCl2、1.0-5.0mM的dATP、1.0-5.0mM的dTTP、1.0-5.0mM的dGTP、1.0-5.0mM的dCTP以及SYBRGreenI。优选地，所述阳性对照液包括第一CYP2C9质粒混合液、第二CYP2C9质粒混合液以及VKORC1质粒混合液，第一CYP2C9质粒混合液含有带有第一个待检测突变位点CYP2C9(8633)的等位基因，第二CYP2C9质粒混合液含有带有第二个待检测突变位点CYP2C9(47639)的等位基因，VKORC1质粒混合液含有带有待检测突变位点VKORC1的等位基因。优选地，所述阴性对照液为Tris-HCL缓冲液，所述的Tris-HCL缓冲液的浓度为7-13mM，pH为7.5-8.5。一种华法林药物相关基因基因多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤步骤S1：对待检测样本抽提DNA样本；步骤S2：取出适量PCR缓冲液，与各基因多态性的检测引物形成的野生型和突变型引物组、内参的检测引物组分别混匀形成各反应液，分装至反应管涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒，之后，分装至各PCR反应管；步骤S3：取出适量PCR缓冲液，与各基因多态性的检测引物形成的突变型引物组分别混匀形成各阳性对照反应液，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒，之后，分装至各PCR反应管；步骤S4：取出适量PCR缓冲液，与各基因多态性的检测引物形成的野生型引物组分别混匀形成各阴性对照反应液，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒，之后，分装至各PCR反应管；步骤S5：加DNA样本，将DNA样本分别加入到步骤S2形成的各反应液的PCR反应管中，将各阳性对照液加入到步骤S3形成的对应的各阳性对照反应液的PCR反应管，将阴性对照液分别加入到步骤S4形成的各阴性对照反应液的PCR反应管中，将所有PCR反应管放入荧光定量PCR仪，设定反应条件，进行扩增反应，得到各扩增产物；步骤S6：检测步骤S5形成的各产物的SYBR信号荧光强度，以SYBR信号荧光强度达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为相关突变基因存在的判断标准。优选地，所述步骤S1中所述的待检测样本为手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋的病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清、胸腔积液或口腔黏膜脱落细胞。从上述技术方案可以看出，本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种华法林药物相关基因基因多态性检测的引物组，其特征在于，包括CYP2C9(8633)基因多态性的检测引物5′‑AG AGGAGCATTGAGGAAC‑3′ SEQ ID NO:15′‑AAGAGGAGCATTGAGGACT‑3′ SEQ ID NO:25′‑TAACAACCAGGACTCAT‑3′ SEQ ID NO:3CYP2C9(47639)基因多态性的检测引物5′‑GCACGAGGTCCAGAGATAGA‑3′ SEQ ID NO:45′‑GCACGAGGTCCAGAGATAGC‑3′ SEQ ID NO:55′‑CGGTGATGGTAGAGGTTTAA‑3′ SEQ ID NO:6VKORC1(3588)基因多态性的检测引物5′‑AGGCGTGAGCCACCGCACAC‑3′ SEQ ID NO:75′‑GCGTGAGCCACCGCACAT‑3′ SEQ ID NO:85′‑TAACAACCAGGACTCAT‑3′ SEQ ID NO:9内参的检测引物5′‑AGCAAGCAGGAGTATGACG‑3' SEQ ID NO:105'‑GAAAGGGTGTAACGCAACT‑3' SEQ ID NO:11。...
【技术特征摘要】
1.一种华法林药物相关基因基因多态性检测的引物组，其特征在于，包括CYP2C9(8633)基因多态性的检测引物5′-AGAGGAGCATTGAGGAAC-3′SEQIDNO:15′-AAGAGGAGCATTGAGGACT-3′SEQIDNO:25′-TAACAACCAGGACTCAT-3′SEQIDNO:3CYP2C9(47639)基因多态性的检测引物5′-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3′SEQIDNO:45′-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3′SEQIDNO:55′-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3′SEQIDNO:6VKORC1(3588)基因多态性的检测引物5′-AGGCGTGAGCCACCGCACAC-3′SEQIDNO:75′-GCGTGAGCCACCGCACAT-3′SEQIDNO:85′-TAACAACCAGGACTCAT-3′SEQIDNO:9内参的检测引物5′-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'SEQIDNO:105'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'SEQIDNO:11。2.一种华法林药物相关基因基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组、PCR缓冲液、阳性对照液和阴性对照液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶、1.0-5.0mM的MgCl2、1.0-5.0mM的dATP、1.0-5.0mM的dTTP、1.0-5.0mM的dGTP、1.0-5.0mM的dCTP以及SYBRGreenI。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液包括第一CYP2C9质粒混合液、第二CYP2C9质粒混合液以及VKORC1质粒混合液，第一CYP2C9质粒混合液含有带有第一个待检测突变位点CYP2C9(8633)的等位基因，第二CYP...
【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，
申请(专利权)人：大连美纳医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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