修饰的杀真菌素链霉菌分离物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及修饰的杀真菌素链霉菌分离物，包含这些分离物的组合物，以及使用此类分离物和组合物以生物合成持久杀菌素(持久霉素)的方法。此外，本发明专利技术涉及修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其以更有效的方式生物合成持久杀菌素并促进持久霉素的产生。

Modified Mycocidal Streptomyces Isolate and Its Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的杀真菌素链霉菌分离物及其用途相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(c)要求于2016年12月6日提交的美国临时申请序列号62/430,455的优先权，所述临时申请的内容在此以其整体通过引用并入。专利
本专利技术涉及修饰的杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)分离物，包含这些分离物的组合物，以及使用此类分离物和组合物以生物合成持久杀菌素(enduracidin；持久霉素(enramycin))的方法。本专利技术进一步涉及修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其以更有效的方式生物合成持久杀菌素并促进持久霉素的产生。专利技术背景持久杀菌素(也称为持久霉素，并且作为Enradin®由MSDAnimalHealth出售)是由细菌杀真菌素链霉菌(用于产生持久杀菌素的天然制造者)生物合成并分泌的天然存在的17个氨基酸的脂酯肽(lipodepsipeptide)抗生素。持久杀菌素是持久杀菌素类似物的通称，且包括持久杀菌素A、B、C和D。所述肽可以从发酵液和菌丝体中分离，其主要作为持久杀菌素A和B(其所连接的脂质链的长度相差一个碳)的混合物。在结构上，持久杀菌素的区别在于通过酰胺键与天冬氨酸残基连接的C12或C132Z,4E支链脂肪酸部分，以及许多非蛋白原性的氨基酸残基(如持久双杀霉素(enduracididine)，4-羟基苯基甘氨酸，3,5-二氯-4-羟基苯基甘氨酸，瓜氨酸和鸟氨酸)的存在。持久杀菌素针对广谱的革兰氏阳性生物体展示有效的体外和体内抗细菌活性，所述革兰氏阳性生物体包括产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)和耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistantEnterococcus,VRE)。持久杀菌素通过与细胞外脂质II(细菌细胞壁的前体)复合而抑制细菌肽聚糖细胞壁的生物合成。脂质II与持久杀菌素复合的位点不同于万古霉素识别的位点，并且是持久杀菌素针对万古霉素抗性生物体的作用的原因。迄今为止，没有证实的持久杀菌素与任何临床使用的抗生素的交叉抗性，并且没有发展，获得或可转移的抗性的证据。没有任何已知形式的可转移抗性机制，缺乏口服生物利用度，其低毒性，以及对梭菌属种(Clostridiumspp.)的显著抗细菌活性，已使持久杀菌素成为控制家禽中梭菌性肠炎的关键抗生素。因此，当在家禽饲料中施用时，持久杀菌素抑制在家禽中引起坏死性肠炎和生长抑制的细菌的生长。持久杀菌素还具有零时间停药期。此外，持久杀菌素在饲料和颗粒中稳定，能够以非常低的剂量向鸡施用，并且不导致在来自处理过的鸡的肉和蛋中发现残留物。多年来，已经获得许多杀真菌素链霉菌菌株，其已经过修饰以改进这些产生持久杀菌素的微生物的效率，所述微生物例如杀真菌素链霉菌B-5477(IFO-12439，ATCC-21013)和杀真菌素链霉菌B-5477-m(IFO-12440，ATCC-21014)[参见例如U.S.3,577,530，U.S.3,786,142和U.S.4,465,771]。然而，仍有进一步改进此类修饰的杀真菌素链霉菌分离物以产生甚至更有效的产生持久杀菌素的微生物的显著需求。本文引用任何参考文献不应被解释为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。专利技术概述因此，本专利技术提供了更有效地产生持久杀菌素的新的修饰的杀真菌素链霉菌分离物。在某些实施方案中，所述修饰的杀真菌素链霉菌分离物编码以下的一种或多种或全部：Orf2798，其与SEQIDNO：2的氨基酸序列具有95％或更高的同一性，并且在氨基酸位置2保留丝氨酸残基；Orf3866，其与SEQIDNO：4的氨基酸序列具有95％或更高的同一性，并且在氨基酸位置124保留苏氨酸残基；Orf5175，其与SEQIDNO：6的氨基酸序列具有95％或更高的同一性，并且在氨基酸位置91保留丝氨酸残基；和Orf5387，其与SEQIDNO：8的氨基酸序列具有95％或更高的同一性，并且在氨基酸位置164保留丝氨酸残基。在某些实施方案中，所述修饰的杀真菌素链霉菌分离物进一步：(i)包含编码Orf4755的核酸，其包含SEQIDNO：9的核苷酸序列，代替SEQIDNO：23的核苷酸序列；和/或(ii)缺乏功能性Orf682蛋白；和/或(iii)缺乏功能性Orf4868蛋白。在这种类型的具体实施方案中，缺乏功能性Orf682蛋白和/或缺乏功能性Orf4868蛋白是由于编码Orf682蛋白和/或Orf4868蛋白的基因中的移码突变。在具体实施方案中，所述修饰的杀真菌素链霉菌分离物编码以下的一种或多种或全部：Orf2798，其与SEQIDNO：2的氨基酸序列具有98％或更高的同一性，并且在氨基酸位置2保留丝氨酸残基；Orf3866，其与SEQIDNO：4的氨基酸序列具有98％或更高的同一性，并且在氨基酸位置124保留苏氨酸残基；Orf5175，其与SEQIDNO：6的氨基酸序列具有98％或更高的同一性，并且在氨基酸位置91保留丝氨酸残基；和Orf5387，其与SEQIDNO：8的氨基酸序列具有98％或更高的同一性，并且在氨基酸位置164保留丝氨酸残基。在某些实施方案中，所述修饰的杀真菌素链霉菌分离物进一步：(i)包含编码Orf4755的核酸，其包含SEQIDNO：9的核苷酸序列，代替SEQIDNO：23的核苷酸序列；和/或(ii)缺乏功能性Orf682蛋白；和/或(iii)缺乏功能性Orf4868蛋白。在这种类型的具体实施方案中，缺乏功能性Orf682蛋白和/或缺乏功能性Orf4868蛋白是由于编码Orf682蛋白和/或Orf4868蛋白的基因中的移码突变。在又另外的实施方案中，所述修饰的杀真菌素链霉菌分离物编码以下的一种或多种或全部：Orf2798，其与SEQIDNO：2的氨基酸序列具有99％或更高的同一性，并且在氨基酸位置2保留丝氨酸残基；Orf3866，其与SEQIDNO：4的氨基酸序列具有99％或更高的同一性，并且在氨基酸位置124保留苏氨酸残基；Orf5175，其与SEQIDNO：6的氨基酸序列具有99％或更高的同一性，并且在氨基酸位置91保留丝氨酸残基；和Orf5387，其与SEQIDNO：8的氨基酸序列具有99％或更高的同一性，并且在氨基酸位置164保留丝氨酸残基。在某些实施方案中，所述修饰的杀真菌素链霉菌分离物进一步：(i)包含编码Orf4755的核酸，其包含SEQIDNO：9的核苷酸序列，代替SEQIDNO：23的核苷酸序列；和/或(ii)缺乏功能性Orf682蛋白；和/或(iii)缺乏功能性Orf4868蛋白。在这种类型的具体实施方案中，缺乏功能性Orf682蛋白和/或缺乏功能性Orf4868蛋白是由于编码Orf682蛋白和/或Orf4868蛋白的基因中的移码突变。在仍另外的实施方案中，所述修饰的杀真菌素链霉菌分离物编码以下的一种或多种或全部：Orf2798，其包含SEQIDNO：2的氨基酸序列；Orf3866，其包含SEQIDNO：4的氨基酸序列；Orf5175，其包含SEQIDNO：6的氨基酸序列；和O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其编码Orf2798蛋白，所述Orf2798蛋白与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有95％或更高的氨基酸序列同一性；其中所述Orf2798蛋白的氨基酸序列在氨基酸位置2包含丝氨酸残基；和其中与用野生型杀真菌素链霉菌菌株获得的持久杀菌素产量相比，用所述修饰的杀真菌素链霉菌获得的持久杀菌素产量增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.06 US 62/4304551.修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其编码Orf2798蛋白，所述Orf2798蛋白与SEQIDNO：2的氨基酸序列具有95％或更高的氨基酸序列同一性；其中所述Orf2798蛋白的氨基酸序列在氨基酸位置2包含丝氨酸残基；和其中与用野生型杀真菌素链霉菌菌株获得的持久杀菌素产量相比，用所述修饰的杀真菌素链霉菌获得的持久杀菌素产量增加。2.权利要求1的修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其中所述Orf2798蛋白由SEQIDNO：1的核苷酸序列编码。3.权利要求1或2的修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其进一步编码Orf3866蛋白，所述Orf3866蛋白与SEQIDNO：4的氨基酸序列具有95％或更高的氨基酸序列同一性；其中所述Orf3866蛋白的氨基酸序列在氨基酸位置124包含苏氨酸残基。4.权利要求3的修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其中所述Orf3866蛋白由SEQIDNO：3的核苷酸序列编码。5.权利要求1、2、3或4的修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其进一步编码Orf5175蛋白，所述Orf5175蛋白与SEQIDNO：6的氨基酸序列具有95％或更高的氨基酸序列同一性；其中所述Orf5175蛋白的氨基酸序列在氨基酸位置91包含丝氨酸残基。6.权利要求5的修饰的杀真菌素链霉菌分离物，其中所述Orf5175蛋白由SEQIDNO：5的核苷酸序列编码。7.权利要求1、2、3、4、5或6的修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：TM扎布瑞斯基，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL