新型链球菌蛋白酶制造技术

本发明专利技术涉及一种名为IgdE的新型链球菌蛋白酶，其显示出IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。本发明专利技术还涉及使用所述链球菌蛋白酶切割IgG的体外方法，使用所述方法产生Fc和Fab片段，以及使用所述方法检测IgG。

New Streptococcal Proteinase

The present invention relates to a novel streptococcal protease named IgdE, which shows the activity of IgG degrading cysteine protease. The invention also relates to an in vitro method for cutting IgG using the streptococcal protease, generating Fc and Fab fragments using the method, and detecting IgG using the method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型链球菌蛋白酶
本专利技术涉及一种新型链球菌蛋白酶，其显示出IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。本专利技术还涉及针对链球菌感染的治疗和疫苗接种，由病原性IgG抗体介导的病症(例如自身免疫疾病)的治疗，以及开发用于生物技术的新工具。
技术介绍
致病菌已经进化出定殖和入侵它们宿主的各种策略，并且使用多种致病因子来促进生长并介导对宿主免疫应答的逃避。为了避免明显的灭绝风险，致病菌必须处理先天免疫反应，但最重要的是还必须处理特异性免疫球蛋白。特异性Ig因启动基于补体的和/或基于吞噬细胞的免疫应答而成为适应性免疫系统的核心。Ig由可变抗原识别Fab区组成，该可变抗原识别Fab区通过柔性铰链区与Fc效应部分连接。Fc区介导与吞噬细胞上的特异性受体的接触或通过结合C1q触发补体的经典途径。因此，铰链区是几种微生物蛋白酶的靶标，其例子包括来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的IdeS(vonPawel-Rammingenetal.2002.EMBOJ.21,1607-161)、来自Porphymonasginivalis的GingipainK(Vincentsetal.2011.FASEBJ.10,3741-3750)和来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的SspA(Prokesováetal.1992.Immunol.Lett.31,259-265)。链球菌感染常见于人类以及家畜(如猪、马和牛)。链球菌感染的严重程度从相对轻微的疾病到严重的危及生命的疾病。非常需要提供可用于人用和兽用疫苗中的链球菌抗原，用于预防、防治和治疗链球菌感染。具有严格序列特异性的蛋白酶可用作生物技术工具。降解免疫球蛋白的蛋白酶可以具有医学用途，例如，可以使用特异性降解IgG的蛋白酶来治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症。
技术实现思路
本专利技术人已经鉴定、纯化和表征了来自链球菌的新型IgG降解酶家族。这个酶家族称为IgdE，即免疫球蛋白G降解酶，是与以前表征的IdeS家族的链球菌免疫球蛋白降解蛋白酶不同的半胱氨酸蛋白酶，并且以高度特异性介导IgG铰链区的有效切割。该酶已在以下菌株中得到鉴定：猪链球菌(S.suis)，命名为IgdEsuis；无乳链球菌(S.agalactiae)，命名为IgdEagalactiae；菌株豕链球菌(S.porcinus)，命名为IgdEporcinus；马链球菌(S.equi)，命名为IgdEequi；假豕链球菌(S.pseudoporcinus)，命名为IgdEpseudoporcinus。来自猪链球菌的IgdE被证明对猪IgG具有高度特异性。与IgM切割蛋白酶IdeSsuis类似，1121个氨基酸大蛋白在蛋白质的N端部分携带蛋白水解活性结构域。全长蛋白质对于体外IgG切割不是必需的，因为由N端470个氨基酸组成的截短的猪链球菌IgdE蛋白保留IgG切割活性。猪链球菌IgdE对猪IgG的切割恰好发生在铰链区半胱氨酸残基的N端，该残基可能在两条IgG重链之间形成共价二硫键。因此，IgG切割导致形成一个64kDaFc片段和两个Fab片段。这种切割模式不同于化脓性链球菌(S.pyogenes)的IgG内肽酶IdeS和IdeSsuis，该IdeS水解下铰链区中的IgG，从而产生一个F(ab')2片段和两个相同的1/2Fc片段(vonPawel-Rammingen，同上)，IdeSsuis则切割来自链内二硫键的IgMC端C端，产生游离的1/2Fc片段(Seeleetal.2015.J.Vet.Res.46,45)。猪链球菌可以例如引起人类和猪的脑膜炎。无乳链球菌可以例如引起人类和牛的脑膜炎和败血症。豕链球菌可以例如引起猪的呼吸道感染、猪窒息。马链球菌可以例如引起马的呼吸道感染、窒息。IgdE家族的蛋白酶可用于预防和治疗链球菌感染，例如用于对链球菌感染免疫的疫苗。IgdE抗体进一步用于被动免疫和治疗与链球菌感染相关的病症。IgdE蛋白酶也可用于开发新型生物技术工具，以及用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症，例如自身免疫疾病、移植排斥、术后治疗和获得性血友病。因此，在第一方面，本专利技术提供了分离的IgdE多肽，其用于在对象中产生免疫应答。分离的IgdE多肽优选为IgdEsuis、IgdEagalactiae、IgdEporcinus、IgdEequi或IgdEpseudoporcinus多肽，或其任何变体或片段，其保留半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生对链球菌的免疫应答。该变体可以是来自另一种细菌的IgdE多肽。该细菌优选是链球菌。在第一方面的一个实施例中，本专利技术提供了分离的IgdE多肽，其用于在对象中产生免疫应答，所述IgdE多肽包括：(a)SEQIDNO：1的氨基酸序列；(b)SEQIDNO：1的变体，所述变体与SEQIDNO：1的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；(c)SEQIDNO：1的片段、SEQIDNO：1的变体或SEQIDNO：1的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌(优选猪链球菌)的免疫应答；(d)SEQIDNO：3的氨基酸序列；(e)SEQIDNO：3的变体，所述变体与SEQIDNO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；(f)SEQIDNO：3的片段、SEQIDNO：3的变体或SEQIDNO：3的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌(优选无乳链球菌)的免疫应答；(g)SEQIDNO：5的氨基酸序列；(h)SEQIDNO：5的变体，所述变体与SEQIDNO：5的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；(i)SEQIDNO：5的片段、SEQIDNO：5的变体或SEQIDNO：5的变体的片段，其能够在对象中产生对豕链球菌的免疫应答；(i)SEQIDNO：7的氨基酸序列；(k)SEQIDNO：7的变体，所述变体与SEQIDNO：7的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；(l)SEQIDNO：7的片段、SEQIDNO：7的变体或SEQIDNO：7的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌(优选马链球菌)的免疫应答；或(m)SEQIDNO：9的氨基酸序列；(n)SEQIDNO：9的变体，所述变体与SEQIDNO：9的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；(o)SEQIDNO：9的片段、SEQIDNO：9的变体、或SEQIDNO：9的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌(优选假豕链球菌)的免疫应答；优选地，免疫应答是保护性免疫应答。优选地，免疫应答产生能够中和免疫对象中感染性链球菌的IgdE的IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性的抗体。在第一方面的另一个实施例中，本专利技术提供了在对象中产生免疫应答的方法，其包括向所述对象以IgdE多肽给药。在第二方面，本专利技术提供了分离的编码IgdE多肽的多核苷酸，用于在对象中产生免疫应答。IgdE多肽优选为IgdEsuis、IgdEagalactiae、IgdEporcinus、IgdEequi或IgdEpseudoporcinus多肽，或其变体或片段，其保留半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于切割IgG的体外方法，所述方法包括使IgG与多肽接触，所述多肽包括：(A)SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的氨基酸序列；(B)其变体，所述变体与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的氨基酸序列具有至少70％一致性且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性；或(C)(a)或(b)的片段，所述片段具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.04 SE 1630021-21.一种用于切割IgG的体外方法，所述方法包括使IgG与多肽接触，所述多肽包括：(A)SEQIDNO：1、3、5、7、9或11的氨基酸序列；(B)其变体，所述变体与SEQIDNO：1、3、5、7、9或11的氨基酸序列具有至少70％一致性且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性；或(C)(a)或(b)的片段，所述片段具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列为SEQIDNO：3。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括在允许发生特异性半胱氨酸蛋白酶活性的条件下，将所述多肽与含有IgG的样品一起培养。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌尔里克·冯·帕维尔·拉明根，克里斯蒂安·施珀里，
申请(专利权)人：杰诺维斯公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE