一种零背景的多片段基因高效率组装方法技术

本发明专利技术公开了一种零背景的多片段基因高效率组装方法，包括如下步骤：构建puc57‑CATP载体；构建克隆有CATP基因片段的质粒；选择目标基因，根据基因长度分为小片段进行基因合成，基因两端添加二类酶位点，连接到克隆载体；多个小片段包括已构建的CATP基因片段用Golden gate克隆反应进行组装，使用T7DNA聚合酶作为连接酶，组装产物转化大肠杆菌，涂布于氨苄和氯霉素抗性的LB平板进行筛选。载体质粒在无需预先经过线性化等处理情况下，通过独特的载体和片段设计，一次性同时高效组装多个基因片段；使用保真性更高的T7DNA连接酶，提高了片段正确组装的概率。

A High Efficiency Assembly Method for Multi-fragment Genes with Zero Background

【技术实现步骤摘要】
一种零背景的多片段基因高效率组装方法
本专利技术涉及生物
，具体是一种零背景的多片段基因高效率组装方法。
技术介绍
基因克隆近年来在农业、畜牧业和医药方面取得丰硕成果，其基本原理是把外源基因与克隆载体进行体外连接，继而转化宿主细胞，筛选出含有目的基因重组质粒的转化子。传统的基因克隆步骤包括:选择目的基因并设计相应引物；用引物PCR扩增目的基因片段；选择合适(抗性标记、酶切位点等)的克隆载体(为了保真扩增)，并将PCR片段连接入克隆载体中，(一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A，可以在Solution1作用下与两端各带一个T的线性载体连接)。随着分子生物学的发展，人们对多基因片段的合成需求随之增长。Goldengate克隆是常用的方法之一，其原理是在小片段两端添加IIs型限制性内切酶识别位点，利用同一种限制性内切酶产生的不同粘性末端，从而一次性组装多个基因片段。然而常规的Goldengate克隆方法使用的T4DNA连接酶可以催化粘性末端或平末端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，满足3/4一致的两个粘性末端均能被催化退火，其次T4DNA连接酶的保真性较低，因此使用传统的T4DNA连接酶在做Goldengate克隆时需要谨慎地设计多个片段的粘性末端，以避免出现粘性末端3/4或者反向3/4一样的情况出现，而设计不合理的Goldengate克隆，使用T4DNA连接酶往往难以得到正确的克隆，连接倾向于形成更少的片段相互连接，使得连接效率进一步降低。传统的Goldengate克隆产物在转化大肠杆菌后，仍然会有少量连接酶将载体和载体被酶切的小片段错连或少连，以及未切干净的载体和少量的PCR模板，这样对于后续的菌落筛选形成了很大的背景干扰。随之而来的这些背景干扰会在大肠杆菌复制的过程中逐渐富集，占据平板克隆总数目的绝大部分，导致组装成功率大幅度降低，甚至组装失败。因此，我们专利技术并改进了一种用于克隆过程中零背景的高效率重组基因的方法。载体质粒在无需预先经过线性化等处理情况下，可以在同一体系中进行限制性内切酶消化和连接，有效地提高多片段连接的准确性；并且通过人为额外添加一段氯霉素抗性基因，可避免克隆载体自身以及PCR模板产生的干扰背景，进行高达10个片段的无缝连接。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种零背景的高效多基因片段构建方法，以解决
技术介绍
中提出的问题。一种零背景的高效组装基因的克隆方法，其步骤包括：步骤一构建puc57-CATP载体；步骤二构建克隆有CATP基因片段的质粒；步骤三选择目标基因，根据基因长度分为小片段进行基因合成，基因两端添加二类酶位点，连接到克隆载体；步骤四多个小片段包括已构建的CATP基因片段用Goldengate克隆反应进行组装，使用T7DNA聚合酶而不是T4DNA聚合酶作为连接酶，能够提高正确组装的概率。组装产物转化大肠杆菌，涂布于氨苄和氯霉素抗性的LB平板进行筛选。优选地，步骤一具体分为如下步骤：(1)puc57-CATP载体包括复制子，氨苄抗性基因和多克隆位点区域，以pCATP-PF/pCATP-PR分别作为上、下游引物PCR扩增获得产物，并回收纯化。(2)以puc57为载体，用EcoRI和HindIII进行双酶切，使用柱回收纯化酶切产物，将步骤(1)获得的PCR产物和酶切后的线性化载体用Gibson重组连接。(3)重组产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，具体步骤如下：A.在2mL离心管中加入50μL冰上融化的TOP10感受态细胞和5μL连接产物，轻轻混匀。B.将离心管在冰上放置30min后，于42℃水浴中热激60s，立即将离心管置于冰上冷却2min。C.加入600μLLB液体培养基，轻轻混匀，37℃，200rpm，恒温振荡培养45min。D.5000rpm离心5min，留200μL菌液涂于IPTG及X-gal的LB固体培养基上，其中固体培养基含50mg/L氨苄霉素；E.涂板正放于37℃恒温箱中5min，再倒置培养12h长出单克隆。(4)重组克隆的鉴定挑取多个单克隆于4mLLB液体培养基中，其中液体培养基含50mg/L氨苄霉素，37℃振荡培养12h至菌液浑浊，抽提质粒并测序。优选地，步骤二具体分为如下步骤：(1)CATP质粒为氯霉素抗性基因的阅读框序列，不包括起始密码子ATG以及上游的启动子序列，基因两端为二类酶酶切位点(见“图3”)，二类酶BsaI酶切后形成的片段粘性末端分别为GCTT和ACGG，粘性末端ACGG和BsaI酶切后的载体puc57-CATP连接。(2)以pACYC-Duet1为模板，用引物CATP-PF/CATP-PR扩增片段，得到的PCR片段胶回收后平端连接EcoRV线性化的pUC57载体。(3)连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞与步骤一的此部分相同。(4)重组克隆的鉴定与步骤一的此部分相同。优选地，步骤三具体分为如下步骤：(1)目标片段分为小片段，并添加二类酶位点目的基因无二类酶位点BsaI，目的基因根据长度分为小片段，设计首尾引物扩增小片段，或通过基因合成合成目的基因的小片段。基因两端添加二类酶BsaI位点及粘性末端，多个基因片段的粘性末端设计原则为：第一个片段5’粘性末端和线性化载体头部一致，为GAAT；最后一个片段的3’粘性末端和线性化载体尾部一致，为GCTT；不同基因片段的4bp的粘性末端互不相同，互不反向互补，避免出现4个碱基中存在连续3个碱基相同或反向互补。(2)小片段连接到克隆载体几个小片段的PCR产物胶回收后，分别连接到EcoRV线性化的pUC57载体。(3)连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞与步骤一的此部分相同。(4)重组克隆的鉴定与步骤一的此部分相同。优选地，步骤四具体分为如下步骤：(1)按照如下体系在0.2mLPCR管内配置组装反应。反应体系，按如下进行配制：(2)反应体系配置完成后，把0.2mLPCR管放在PCR仪器上盖好橡胶垫，按照下面的PCR反应条件设置反应程序。注意一定要把PCR仪器的盖子盖紧。设置PCR仪反应程序如下：(3)连接产物转化A.在2mL离心管中加入50μL冰上融化的TOP10感受态细胞和5μL上述重组产物，轻轻混匀。B.将离心管在冰上放置30min后，于42℃水浴中热激60s，立即将离心管置于冰上冷却2min。C.加入600μLLB液体培养基，轻轻混匀，37℃，200rpm，恒温振荡培养45min。D.5000rpm离心5min，留200μL菌液涂于LB固体培养基上，其中固体培养基含50mg/L氨苄霉素和12.5mg/L氯霉素；E.涂板正放于37℃恒温箱中5min，再倒置培养12h长出单克隆。(4)重组克隆的鉴定与步骤一的此部分相同。本专利技术的有益效果是：本专利技术的零背景的多片段基因高效率组装方法，主要利用II型限制性内切酶切割位点位于识别位点外侧的特点，设计带有特定粘性末端的PCR引物引入不同的目的片段。前期T7DNA连接酶提高了片段正确组装的概率，后期氨苄和氯霉素双重抗性筛选得到重组正确率高达100％的阳性克隆。该方案具有如下优点：1)本专利技术包括构建适用的载体：puc57-CATP载体，CATP基因片段质粒；2)克隆载体和表达载体质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种零背景的多片段基因高效率组装方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一构建puc57‑CATP载体；步骤二构建克隆有CATP基因片段的质粒；步骤三选择目标基因，根据基因长度分为小片段进行基因合成，基因两端添加二类酶位点，连接到克隆载体；步骤四多个小片段包括已构建的CATP基因片段用Golden gate克隆反应进行组装，使用T7 DNA聚合酶作为连接酶，组装产物转化大肠杆菌，涂布于氨苄和氯霉素抗性的LB平板进行筛选。

【技术特征摘要】
1.一种零背景的多片段基因高效率组装方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一构建puc57-CATP载体；步骤二构建克隆有CATP基因片段的质粒；步骤三选择目标基因，根据基因长度分为小片段进行基因合成，基因两端添加二类酶位点，连接到克隆载体；步骤四多个小片段包括已构建的CATP基因片段用Goldengate克隆反应进行组装，使用T7DNA聚合酶作为连接酶，组装产物转化大肠杆菌，涂布于氨苄和氯霉素抗性的LB平板进行筛选。2.根据权利要求1所述的零背景的多片段基因高效率组装方法，其特征在于：步骤一具体分为如下步骤：(1)puc57-CATP载体包括复制子，氨苄抗性基因和多克隆位点区域，以pCATP-PF/pCATP-PR分别作为上、下游引物PCR扩增获得产物，并回收纯化；(2)以puc57为载体，用EcoRI和HindIII进行双酶切，使用柱回收纯化酶切产物，将步骤(1)获得的PCR产物和酶切后的线性化载体用Gibson重组连接；(3)重组产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，具体步骤如下：A.在2mL离心管中加入50μL冰上融化的TOP10感受态细胞和5μL连接产物，轻轻混匀；B.将离心管在冰上放置30min后，于42℃水浴中热激60s，立即将离心管置于冰上冷却2min；C.加入600μLLB液体培养基，轻轻混匀，37℃，200rpm，恒温振荡培养45min；D.5000rpm离心5min，留200μL菌液涂于IPTG及X-gal的LB固体培养基上，其中固体培养基含50mg/L氨苄霉素；E.涂板正放于37℃恒温箱中5min，再倒置培养12h长出单克隆；(4)重组克隆的鉴定挑取多个单克隆于4mLLB液体培养基中，其中液体培养基含50mg/L氨苄霉素，37℃振荡培养12h至菌液浑浊，抽提质粒并测序。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34