本发明专利技术公开了一种高效的一步组装多个基因片段的方法，包括overlap PCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤为：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR，先通过特异性引物的overlap PCR获得较纯的大片段PCR，再通过Gibson组装到目标载体，获得基因全长。本发明专利技术相较常规的PCR拼接，PCR产物特异性更强，产量更高，更适合做后续的Gibson组装应用该方法可大大缩短3k‑8k的大基因合成的时间，只需要一轮时间，并且该方法很稳定，适合于大规模基因合成和自动化。
An Efficient One-Step Method for Assembling Multiple Gene Fragments
【技术实现步骤摘要】
一种高效的一步组装多个基因片段的方法
本专利技术属于基因片段组装
，具体地，涉及一种高效的一步组装多个基因片段的方法。
技术介绍
合成生物学研究逐渐发展迅速掀起一股潮流，关键在于DNA大片段组装方法的突破。将两个或更多DNA片段按照设计组装在一起一直是生物学研究中非常基础且重要的一步。在启动子和外显子功能研究、蛋白质功能研究以及基因操作等传统领域中DNA连接技术都有广泛的应用。尽管现在开发了同源重组依赖的体内DNA大片段组装等技术，但是在基因组大片段克隆上仍然存在不足，首先大片段扩增的能力有限，其次长片段的突变率会随之增加，但是对于一个完整大片段的测序和回复突变都是需要很长的时间和花费很大的精力。对于全基因合成技术，是通过不对称PCR技术合成初期的PCR片段，但是此PCR片段不可能一次合成很长。所以要通过一定的拼接策略，往往要多轮PCR，但是这样又会带进去较多的突变。同时单纯的使用PCR合成的长度非常有限，往往Ikb左右，目前销售的cloneeazy系统可以实现分段克隆，所以一些拥有此专利的公司能够实现较长DNA片段的合成，但是此系统需要分段测序，合成速度较慢。在多基因载体构建方面，随着生物学研究的深入，将突破单个基因研究进行多基因相互协调的研究，单个基因进行转化将不能胜任。所以将多个基因构建在同一个载体上并且进行一次性转化的技术将非常必要，目前虽然有一些多基因组装系统，但是操作相对复杂。每个基因加入需要多步的操作，而且不能实现无缝连接。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了解决上述的问题，而提供一种高效的一步组装多个基因片段的方法，本方法相较常规的PCR拼接，PCR产物特异性更强，产量更高，更适合做后续的Gibson组装，且应用该方法可大大缩短3k-8k的大基因合成的时间，只需要一轮时间，并且该方法很稳定，适合于大规模基因合成和自动化。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种高效的一步组装多个基因片段的方法，包括overlapPCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤如下：步骤(1)overlapPCR：设计引物时，upper1和lower2除了是各自目标片段的引物外，还是整个长片段产物的引物，即在考虑错配位点时，既要考虑目标片段还要考虑长片段。lower2和upper2是保证连接的关键引物，它们均由两部分组成，一部分与各自目标片段互补，另一部分与待连接的另一片段互补，保证这两条引物之间的互补区包含至少20bp。第一轮PCR：分别用引物对upper1和lower1、upper2和lower2对目标待融合片段进行PCR扩增，分别将两种产物回收，得到A和B片段；第二轮PCR：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR；步骤(2)Gibson同源重组：通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，这部分对应的退火温度高于48摄氏度，将一个目的基因构建到表达载体上，同时在这个目的蛋白的N端融合上一个大的融合标签，帮助蛋白表达/检测/纯化；将设计引物扩增出这两个DNA片段，同时这两个DNA片段有各有一部分是同源的，同时这两个DNA片段与载体上各有一部分是同源的，这样便于它们与载体进行连接；然后，两个DNA片段进行克隆之后，再进行DNA纯化，最后将线性化的载体片段，这两个DNA片段和Gibsonassemblymastermix孵育一个小时后直接转化感受态细胞，实现将PCR组装到目标载体。进一步地，步骤(1)中所述第二轮PCR的PCR扩增具体包括以下步骤：S1变性：设定温度为85℃-95℃，高温使模板片段A和片段B中的双链DNA解离形成单链，解离时间为28s-35s，再将解离后的模板至入浓度为70％的甲酰胺中变性5分钟，温度设定为73℃；S2退火：设定温度为55℃-60℃，低温下将引物upper1和lower2与模板片段A和片段B互补区结合，退火时间为27s-33s；S3延伸：设定温度为70℃-73℃，中温下DNA聚合酶催化以模板片段A和片段B为起始点的DNA链延伸反应，延伸时间为35s-65s；S4：重复S1-S3步骤28-33轮，完成PCR扩增。进一步地，S2退火设定的温度为58℃，且退火时间为32s，S3延伸设定的温度为72℃，且S3延伸时间为40s，S4重复S1-S3步骤的轮数为30轮。进一步地，步骤(1)的第二轮PCR电泳观察测序具体步骤为：A：称取适量的琼脂糖，放入三角瓶中，加入0.5*TBE，在微波炉上加热，将琼脂糖熔化；B：然后，待凝胶温度降至55摄氏度以下，加入2-3微升的0.5mg/ml的溴化乙锭，再将移胶板放入胶室中，并将梳子垂直安插在移胶板上方，将熔化的琼脂糖倒入放有移胶板的胶室中；C：等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状，将梳子垂直拔出，用拇指和指示轻持移胶板两侧，将凝胶体放入加有0.5*TBE电泳缓冲液的电泳槽中，并加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液浸没胶面，高出胶面；D：取1-2微升上样缓冲液滴在封口膜上，与模板片段A和片段B扩增的PCR样品混合均匀后，一同加入到凝胶孔中，样品沉淀于孔底，再加入模板片段A和片段B扩增的PCR样品；E：盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压以及电泳方向，打开电源开关，开始电泳，DNA样品从负极向正极移动；F：最后，前面色素接近胶的先端，切断电流，停止电泳，打开槽盖，取出样品，在紫外灯下观察，摄像，检测序列是否正确。进一步地，步骤(2)中所述DNA纯化的具体步骤为：步骤一：在待纯化的含有片段A和片段B的DNA溶液中加等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液，然后在涡旋混匀器上充分混匀，混匀时间为5-8min；步骤二：将混合物12000r/min离心10min后，移取上层含DNA的水相到另一离心管中，若在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则重新抽提水相，直到两相交界处无明显沉淀物；步骤三、向上层水相中加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)混合液，在涡旋混匀器上充分混匀后12000r/min离心10min；步骤四：移取上层含DNA的水相到另一离心管中，加1/10体积的醋酸钠溶液，充分混匀，再向管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，于-20℃保存30min；步骤五：12000r/min离心5min，弃上清液，75％的乙醇12000r/min离心洗涤5min，弃上清液，用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15min；步骤六：在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液，溶解后在-20℃以下长期保存，完成DNA纯化。进一步地，步骤三中所述氯仿：异戊醇混合液的氯仿与异戊醇的浓度比为24:1。本专利技术的有益效果：1、本专利技术相较常规的PCR拼接，PCR产物特异性更强，产量更高，更适合做后续的Gibson组装应用该方法可大大缩短3k-8k的大基因合成的时间，只需要一轮时间，并且该方法很稳定，适合于大规模基因合成和自动化。2、本专利技术在对模板片段A和片段B进行PCR扩增过程中，设定温度为85℃-95℃，高温使模板片段A和片段B中的双链DNA解离形成单链，再将本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，包括overlap PCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤如下：步骤(1)overlap PCR：第一轮PCR：分别用引物对upper1和lower1、upper2和lower2对目标待融合片段进行PCR扩增，分别将两种产物回收，得到A和B片段；第二轮PCR：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR；步骤(2)Gibson同源重组：通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，这部分对应的退火温度高于48摄氏度，将一个目的基因构建到表达载体上，同时在这个目的蛋白的N端融合上一个大的融合标签，帮助蛋白表达/检测/纯化；将设计引物扩增出这两个DNA片段，同时这两个DNA片段有各有一部分是同源的，同时这两个DNA片段与载体上各有一部分是同源的；然后，两个DNA片段进行克隆之后，再进行DNA纯化，最后将线性化的载体片段，这两个DNA片段和Gibson assembly master mix孵育一个小时后直接转化感受态细胞，实现将PCR组装到目标载体。...
【技术特征摘要】
1.一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，包括overlapPCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤如下：步骤(1)overlapPCR：第一轮PCR：分别用引物对upper1和lower1、upper2和lower2对目标待融合片段进行PCR扩增，分别将两种产物回收，得到A和B片段；第二轮PCR：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR；步骤(2)Gibson同源重组：通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，这部分对应的退火温度高于48摄氏度，将一个目的基因构建到表达载体上，同时在这个目的蛋白的N端融合上一个大的融合标签，帮助蛋白表达/检测/纯化；将设计引物扩增出这两个DNA片段，同时这两个DNA片段有各有一部分是同源的，同时这两个DNA片段与载体上各有一部分是同源的；然后，两个DNA片段进行克隆之后，再进行DNA纯化，最后将线性化的载体片段，这两个DNA片段和Gibsonassemblymastermix孵育一个小时后直接转化感受态细胞，实现将PCR组装到目标载体。2.根据权利要求1所述的一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，步骤(1)中所述第二轮PCR的PCR扩增具体包括以下步骤：S1变性：设定温度为85℃-95℃，高温使模板片段A和片段B中的双链DNA解离形成单链，解离时间为28s-35s，再将解离后的模板至入浓度为70％的甲酰胺中变性5分钟，温度设定为73℃；S2退火：设定温度为55℃-60℃，低温下将引物upper1和lower2与模板片段A和片段B互补区结合，退火时间为27s-33s；S3延伸：设定温度为70℃-73℃，中温下DNA聚合酶催化以模板片段A和片段B为起始点的DNA链延伸反应，延伸时间为35s-65s；S4：重复S1-S3步骤28-33轮，完成PCR扩增。3.根据权利要求2所述的一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，S2退火设定的温度为58℃，且退火时间为32s，S3延伸设定的温度为72℃，且S3延伸时间为40s，S4重复S1-S3步骤的轮数为30轮。4.根据权利要求1所述的一种高效的一步组装多...
【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，喻明军，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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