使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法及其应用。本发明专利技术通过使用裂解液裂解生物样品，得到裂解产物；通过差速离心去除裂解液中的碎片，得到裂解后的上清液；使用分子筛离心柱来纯化裂解后的上清液，得到高纯度的mRNA核糖体新生肽链复合物。该方法不需要贵重仪器超速离心机，操作简单，步骤少，被RNase污染的概率小，实验重复性高，分子筛离心柱纯化步骤耗时只需10min左右，极大地缩短了实验时间，且可以大批量操作，解决了蔗糖密度超速离心法耗时长，操作难度高，通量低等限制，同时可以获得高质量的RNC‑mRNA测序数据，对RNC技术推广有重要推动作用。

Rapid and complete acquisition of RNA ribosome-derived peptide chain complexes using zeolite centrifugal column and its application

【技术实现步骤摘要】
使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法及其应用
本专利技术属于生命科学
，特别涉及一种使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法及其应用。
技术介绍
翻译调控是生命体内的重要调控层次，翻译调控占据生命体总调控的50％以上，在生命体中基因被表达不代表进入翻译过程合成蛋白质，因此对生命体的翻译状况进行研究极为重要。细胞进行翻译时，核糖体结合在mRNA链上并移动并合成蛋白质，这种完整mRNA和核糖体以及新生肽链组成的复合体就是mRNA核糖体新生肽链复合物(RibosomeNascent-chainComplex,RNC)，只有提取到完整未降解的RNC，才能对正在翻译的mRNA进行定性定量研究。目前RNC的常用提取方法是蔗糖密度超速离心法，此方法能够提取出完整未降解的RNC，保留核糖体上全长的mRNA和新生肽链以供其后的各种生化与分子生物学研究(Wangetal.,2013；Zhangetal.,2009)，可用于动物、植物、微生物的培养细胞和组织(中国专利技术专利ZL201510332732，ZL201410452522，ZL201410387213)。目前已发表的文献和专利使用的都是蔗糖密度超速离心法，虽然蔗糖密度超速离心法可以提取出完整未降解的RNC，但是该方法需要贵重仪器如超速离心机，耗材(如超速离心管等)成本高，操作繁琐，包括超速离心机预冷2h、蔗糖梯度溶液的配制、超速离心机上机前配平(要求误差为0.01g以内)、超速离心管内RNC的重悬等，因此实验时间漫长(根据样品量和转头的不同需5～13h，如果盲目通过提高离心力来缩短离心时间会导致杂质污染)，蔗糖溶液无法灭菌因而混入RNase的概率大，配平过程需要将裂解上清移至室温操作，易造成RNC的降解，回收率较低，批次间操作不慎容易造成差异，对操作者的经验和操作精细程度有很大的要求。微量样品的提取风险很大，沉淀肉眼难以寻找且容易溶解，并且每次提取的样品数目有限，这些限制条件极大的阻碍了RNC技术的实验室推广和商业应用。传统层析系统(如GEAKTAPure系统)在原理上支持纯化生物样品中的RNC，但是由于层析系统纯化时间过长，许多实验组份无法高压灭活RNase，尤其是层析柱和填料无法灭活RNase，极易导致RNC-RNA降解，不能获取到全长mRNA，也就无法对正在翻译中的mRNA进行定性定量研究，只能用于提取核糖体蛋白。降解严重时甚至导致RNC解体，连新生肽链都难以提取到。因此目前提取RNC的成熟方法只有蔗糖密度超速离心法，缺乏一种快速、简便、高通量的技术。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法。本专利技术首次提出使用分子筛离心柱方法提取mRNA核糖体新生肽链复合物，优化了一整套技术方案。利用分子筛超大分子量物质直接穿透的特性，结合低速离心作为纯化手段，不需要贵重仪器超速离心机和层析系统，只需要普通低速离心机即可，实验步骤少，操作简单，被RNase污染概率小，大幅缩短实验时间、极大降低实验成本的同时能够得到和蔗糖密度超速离心法质量相同、甚至更优的RNC-mRNA测序数据，可以有效克服当前方法成本高，操作复杂，通量低的技术缺陷。本专利技术的另一目的在于提供上述使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法，包括如下步骤：(1)使用裂解液裂解生物样品，得到裂解产物；通过差速离心去除裂解液中的碎片，得到裂解后的上清液；(2)使用分子筛离心柱来纯化裂解后的上清液，得到高纯度的mRNA核糖体新生肽链复合物。步骤(1)中所述的裂解液为含翻译延伸抑制剂和TritonX-100的盐缓冲液。步骤(1)中所述的裂解液可采用市售产品，采用现有技术公开的常用细胞裂解方法，本领域技术人员可根据实际情况选择适当的方法和条件，本专利技术对此不作具体限定。所述的裂解液中的翻译延伸抑制剂优选为放线菌酮或氯霉素；放线菌酮适用于真核生物，氯霉素适用于原核生物。所述的放线菌酮的浓度优选为0.05～0.15mg/mL；更优选为0.1mg/mL。所述的氯霉素的浓度优选为0.05～0.15mg/mL；更优选为0.1mg/mL。所述的TritonX-100的浓度为体积百分比0.1～1.5％；更优选为0.2～1％。步骤(1)中所述的生物样品包括真核生物和原核生物。所述的生物样品为真核生物时，所述的裂解液的组成优选如下：15～25mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液、10～20mMMgCl2、150～250mMKCl、50～150μg/ml放线菌酮、1～3mMDTT、0.5～1.5％(v/v)TritonX-100；更优选如下：20mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液、15mMMgCl2、200mMKCl、100μg/ml放线菌酮、2mMDTT、1％(v/v)TritonX-100。所述的生物样品为原核生物时，所述的裂解液的组成优选如下：5～15mM、pH7.8的Tris-HCl、5～15mMMgCl2、30～70mMNH4Cl、0.1～0.3％(v/v)TritonX-100、100μg/ml氯霉素；更优选如下：10mM、pH7.8的Tris-HCl、10mMMgCl2、50mMNH4Cl、0.2％(v/v)TritonX-100、100μg/ml氯霉素。为了更有利于从所述的生物样品提取完整的RNC，对于不同的生物样品在加入裂解液前的处理可参考国家专利技术专利ZL201510332732、ZL201410452522、ZL201410387213。所述的生物样品为原核生物时，在加入所述的裂解液前优选还包括如下处理步骤：在原核生物细胞中加入溶菌酶溶液和MgCl2溶液处理。该步骤有利于原核生物细胞被裂解液裂解，同时保持RNC的完整性。步骤(1)中所述的差速离心的条件优选为于16000～18000g离心10～20min；更优选于17000g离心15min。步骤(2)中所述的分子筛离心柱所使用的分子筛离心柱填料优选排阻范围为2×104～8×106Da的分子筛离心柱填料。步骤(2)中所述的使用分子筛离心柱纯化裂解后的上清液的具体步骤优选如下：(A)取出分子筛离心柱，使用柱平衡缓冲液进行柱平衡，然后置于2～8℃环境下待柱填料沉降完全；(B)取出沉降好的分子筛离心柱，离心除去柱内的溶液，得到制备好的柱子；(C)将裂解后的上清液滴加到分子筛离心柱柱床表面，离心收集滤液，得到纯化好的高纯度RNC。步骤(A)中所述的分子筛离心柱包含但不限于MicroSpinS-400HR-GEHealthcare分子筛离心柱。使用相近排阻范围的其它厂商分子筛离心柱均可达到相同的纯化效果。步骤(A)中所述的柱平衡缓冲液的组成如下：所述的生物样品为真核生物时，所述的柱平衡缓冲液的组成优选如下：15～25mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液、10～20mMMgCl2、150～250mMKCl；更优选如下：20mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液、15mMMgCl2、200mMKCl；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用裂解液裂解生物样品，得到裂解产物；通过差速离心去除裂解液中的碎片，得到裂解后的上清液；(2)使用分子筛离心柱来纯化裂解后的上清液，得到高纯度的mRNA核糖体新生肽链复合物。

【技术特征摘要】
1.一种使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用裂解液裂解生物样品，得到裂解产物；通过差速离心去除裂解液中的碎片，得到裂解后的上清液；(2)使用分子筛离心柱来纯化裂解后的上清液，得到高纯度的mRNA核糖体新生肽链复合物。2.根据权利要求1所述的使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的裂解液为含翻译延伸抑制剂和TritonX-100的盐缓冲液；步骤(1)中所述的差速离心的条件为于16000～18000g离心10～20min；步骤(2)中所述的分子筛离心柱所使用的分子筛离心柱填料的排阻范围为2×104～8×106Da。3.根据权利要求2所述的使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：所述的翻译延伸抑制剂为放线菌酮或氯霉素；所述的放线菌酮的浓度为0.05～0.15mg/mL；所述的氯霉素的浓度为0.05～0.15mg/mL；所述的TritonX-100的浓度为体积百分比0.1～1.5％。4.根据权利要求1所述的使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的生物样品为真核生物时，所述的裂解液的组成如下：15～25mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液、10～20mMMgCl2、150～250mMKCl、50～150μg/ml放线菌酮、1～3mMDTT、0.5～1.5％(v/v)TritonX-100；步骤(1)中所述的生物样品为原核生物时，所述的裂解液的组成如下：5～15mM、pH7.8的Tris-HCl、5～15mMMgCl2、30～70mMNH4Cl、0.1～0.3％(v/v)TritonX-100、100μg/ml氯霉素。5.根据权利要求1所述的使用分子筛离心柱快速完整获取mRNA核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的生物样品为原核生物，在加入所述的裂解液前还包括如下处理步骤：在原核生物细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢小龙，张弓，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44