一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法技术

本发明专利技术公开了一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，包括如下步骤：第一步、在全自动DNA合成仪上合成DNA引物，自动脱去单体上的第一个碱基5’‑OH基团上的DMTr保护基；第二步、注入离子交换高效液相色谱系统进行粗检测；第三步、去除杂质短链DNA；第四步、脱除亚磷酰胺单体；第五步、进一步纯化处理；第六步、纯度检测。本发明专利技术通过将带DMT的DNA先进行HPLC纯化用以除去短片段，之后进行脱DMT步骤，然后进一步纯化，带DMT的DNA极性很弱，有很强的疏水性，不带DMT的短片断就能通过HPLC纯化被高效分离，然后对带DMT的目标分子量抽干后加10％的醋酸处理，使DMT完全脱除，处理后的引物继续进行HPLC纯化，可以得到高质量的DNA引物，纯度达到99％以上。

An improved method for purification of long-chain DNA primers by high performance liquid chromatography

【技术实现步骤摘要】
一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法
本专利技术属于DNA引物纯化
，具体地，涉及一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法。
技术介绍
目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5→3方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3'→5磷酸二酯键连接。基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别不同之处在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。而在DNA合成反应过程会产生的短片段以及脱保护基团时产生的铵盐，因此需要在合成结束后，将引物分子从CPG上切下，再进行进一步的纯化。基于以上合成的原理和步骤，目前，常见的几种纯化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、HPLC。HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)高效液相色谱法是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，依据DNA的疏水性来分离产物的。它在用于分离纯化时因具备高性能色谱柱，高精密度输液泵，高灵敏度检测器等一系列优点，可以有效的去除大部分N-短片段，因而可以除去失败序列或未结合的标记物，从而对DNA片段进行纯化。同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。由于HPLC产品的纯度非常高，分析时间短，可广泛应用于医药，环保，食品工业，生命科学等领域，针对小于40个碱基的未修饰寡核苷酸引物和修饰引物的纯化，如果对制品的纯度要求非常高，HPLC则是很好的纯化方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，通过将带DMT的DNA先进行HPLC纯化用以除去短片段，之后进行脱DMT步骤，然后进一步纯化，带DMT的DNA极性很弱，有很强的疏水性，能很好吸附在C18柱上，不带DMT的短片断就能通过HPLC纯化被高效分离。然后对带DMT的目标分子量抽干后加10％的醋酸处理20-30min，使DMT完全脱除，处理后的引物继续进行HPLC纯化，可以得到高质量的DNA引物，纯度达到99％以上。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，包括如下步骤：第一步、首先在全自动DNA合成仪上合成DNA引物，自动脱去单体上的第一个碱基5’-OH基团上的4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基，得到DNA合成粗产物；第二步、将上一步得到的DNA合成粗产物注入分离性能极强的离子交换高效液相色谱系统，进行粗检测，确认主峰位置和目的DNA含量；第三步、增加注样量，回收主峰平头部分，去除杂质短链DNA，得到带亚磷酰胺单体的DNA引物；第四步、对带亚磷酰胺单体的DNA引物抽干后加醋酸水溶液处理20-30min，脱除亚磷酰胺单体；第五步、将上一步脱除亚磷酰胺单体的DNA引物再次注入离子交换高效液相色谱系统进行进一步纯化处理；第六步、将上一步回收后的DNA进行纯度检测，确认纯度达到99％以上，完成纯化。进一步地，DNA引物一次的纯化量为1OD。进一步地，第四步中所述醋酸水溶液的质量分数为10％，抽干后的DNA引物与加入的醋酸水溶液的质量比为1:12-14。进一步地，第四步中振动处理器包括反应框和安装于反应框上的振动装置，两个所述振动装置对称安装于反应框的两侧；所述反应框的两个端侧表面均设有安装筒；所述振动装置包括支撑底板，所述支撑底板的表面开有滑槽，所述滑槽内安装有滑动块，所述滑动块与滑槽滑动配合；所述滑动块的表面开有第二安装通孔；所述支撑底板的表面边缘位置垂直固定有支撑竖板，所述支撑竖板的表面开有第一安装通孔，第一安装通孔内通过轴承贯穿安装有第一轴杆，所述第一轴杆上固定有第一圆盘，所述第一圆盘上设有依次相互连接的第二圆盘和第三圆盘所述，第一圆盘与第二圆盘之间、第二圆盘和第三圆盘之间均通过连杆连接；所述第三圆盘表面中心位置固定有第二轴杆，所述第二轴杆活动安装于滑动块表面的第二圆形通孔内；所述滑动块的侧表面垂直固定有连接杆，连接杆与安装筒配合，反应框通过安装筒安装于连接杆上。进一步地，所述支撑竖板平行于滑槽设置。进一步地，所述第一圆盘、第二圆盘和第三圆盘表面沿圆周方向均均布有固定轴，固定轴与连杆活动连接。本专利技术的有益效果：本专利技术针对长链DNA引物纯化方法的改进，主要是将带DMT的DNA先进行HPLC纯化用以除去短片段，之后进行脱DMT步骤，然后进一步纯化。HPLC纯化是依据不同大小的片段带有的净荷多少来分离产物的；合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢，因为带DMT的DNA极性很弱，有很强的疏水性，能很好吸附在C18柱上，不带DMT的短片断就能通过HPLC纯化被高效分离。然后对带DMT的目标分子量抽干后加10％的醋酸水溶液于特制的振动处理器内振荡处理20-30min，将抽干后的DNA引物和醋酸水溶液放置于反应框内，通过反应框来回往复移动，使得DNA引物和醋酸水溶液的接触更加充分，反应更加完全，在短时间内实现DMT的完全脱除，实现方式自动化，能够有效提高工作效率、节约人力；振荡处理后的引物继续进行HPLC纯化，可以得到高质量的DNA引物，纯度达到99％以上。附图说明为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。图1为本专利技术中振动处理器的结构示意图；图2为本专利技术中振动处理器的反应框的结构示意图；图3为本专利技术中振动处理器的振动装置的结构示意图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，包括如下步骤：第一步、首先在全自动DNA合成仪上合成DNA引物，自动脱去单体上的第一个碱基5’-OH基团上的DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)保护基，得到DNA合成粗产物；第二步、将上一步得到的DNA合成粗产物注入分离性能极强的离子交换高效液相色谱系统，进行粗检测，确认主峰位置和目的DNA含量；第三步、增加注样量，回收主峰平头部分，此时可达到去除杂质短链DNA的目的，得到带DMT(亚磷酰胺单体)的DNA引物；较优的，为了确保DNA引物的纯度，一般一次的纯化量为1OD；第四步、对带DMT的DNA引物抽干后，置于振动处理器的反应框1内，再往里加入10％(质量分数)的醋酸水溶液，于振动处理器内振荡处理20-30min，达到脱除DMT的目的；其中，抽干后的DNA引物与加入的醋酸水溶液的质量比为1:12-14；第五步、将上一步脱除DMT的DNA引物注入离子交换高效液相色谱系统进行进一步纯化处理；第六步、将回收后的DNA进行纯度检测，确认纯度达到99％以上，完成纯化。请参阅图1-3所示，第四步中振动处理器，如图1所示，包括反应框1和安装于反应框1上的振动装置2，其中，两本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步、首先在全自动DNA合成仪上合成DNA引物，自动脱去单体上的第一个碱基5’‑OH基团上的4,4'‑二甲氧基三苯甲基保护基，得到DNA合成粗产物；第二步、将上一步得到的DNA合成粗产物注入离子交换高效液相色谱系统，进行粗检测，确认主峰位置和目的DNA含量；第三步、增加注样量，回收主峰平头部分，去除杂质短链DNA，得到带亚磷酰胺单体的DNA引物；第四步、对带亚磷酰胺单体的DNA引物抽干后，置于振动处理器的反应框(1)内，再往里加入醋酸水溶液，于振动处理器内振荡处理20‑30min，脱除亚磷酰胺单体；第五步、将上一步脱除亚磷酰胺单体的DNA引物再次注入离子交换高效液相色谱系统进行进一步纯化处理；第六步、将上一步回收后的DNA进行纯度检测，确认纯度达到99％以上，完成纯化。

【技术特征摘要】
1.一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步、首先在全自动DNA合成仪上合成DNA引物，自动脱去单体上的第一个碱基5’-OH基团上的4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基，得到DNA合成粗产物；第二步、将上一步得到的DNA合成粗产物注入离子交换高效液相色谱系统，进行粗检测，确认主峰位置和目的DNA含量；第三步、增加注样量，回收主峰平头部分，去除杂质短链DNA，得到带亚磷酰胺单体的DNA引物；第四步、对带亚磷酰胺单体的DNA引物抽干后，置于振动处理器的反应框(1)内，再往里加入醋酸水溶液，于振动处理器内振荡处理20-30min，脱除亚磷酰胺单体；第五步、将上一步脱除亚磷酰胺单体的DNA引物再次注入离子交换高效液相色谱系统进行进一步纯化处理；第六步、将上一步回收后的DNA进行纯度检测，确认纯度达到99％以上，完成纯化。2.根据权利要求1所述的一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，其特征在于，DNA引物一次的纯化量为1OD。3.根据权利要求1所述的一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，其特征在于，第四步中所述醋酸水溶液的质量分数为10％，抽干后的DNA引物与加入的醋酸水溶液的质量比为1:12-14。4.根据权利要求1所述的一种长链DNA引物的HPLC纯化改进的方法，其特征在于，第四步中振动处理器包括反应框(1)和安装于反应框(1)上的振动装置(2)，两个所述振动装置(2)对称安装于反应框(1)的两侧；所述反应框(1)的两个端...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，占应强，刘宗文，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34