生物相容性多孔冷冻凝胶微球及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种生物相容性多孔冷冻凝胶微球及其制备方法。它借助液滴微流控技术，高通量地形成均匀的含有凝胶预聚体液滴；继而通过冷冻条件下聚合反应，形成冷冻凝胶微球。由于该微球具有可调控的多孔结构和粗糙的表面性质，可以允许细胞高密度负载和生长。这种凝胶球还兼具优良的生物相容性，克服了传统高分子凝胶球包覆细胞后再交联带来的细胞毒性，使其作为细胞外基质时使用更为方便、可靠。进一步在凝胶球交联体系中加入一定比例的线形或者树形烷氧醚分子，制备复合凝胶微球，能够赋予其智能温度响应性能，从而特别有利于构建智能仿生基质。由于以上创新性，该种材料有望替代传统的天然细胞外基质，广泛应用于仿生组织和器官的构建。

Biocompatible porous frozen gel microspheres and preparation method thereof

【技术实现步骤摘要】
生物相容性多孔冷冻凝胶微球及其制备方法
本专利技术涉及一种特殊结构和性质高分子功能微球的制备方法，特别是作为细胞外基质的具有生物相容性、高通量、高均一性的生物相容性多孔冷冻凝胶微球及其制备方法。
技术介绍
凝胶是细胞外基质的主要存在形式，是细胞生长环境的关键组成部分，因此在细胞培养、生物组织模仿、人造器官模型中具有重要的意义。相比于培养皿的二维细胞培养环境，凝胶能够给细胞提供三维的环境，更加接近细胞的自然环境。由于细胞的代谢活动及其行为与其生长环境息息相关，因此采用凝胶作为载体构建细胞相关组织和器官模型，相比二维系统能够更准确地模拟生理功能，预测自然环境下细胞的行为。开发生物相容的、具有特定功能的凝胶材料在生命模型构建、药物和环境毒性评估、个性化医疗等领域都具有重要的应用价值。但是现有的商业化凝胶细胞外基质种类相对单一，大多来源于天然高分子材料，其功能较为单一，还存在凝胶的稳定性和机械性能较差、批次间存在差异、难以精确确定所有成分等问题，严重局限了其适用范围。相比而言，改性高分子凝胶材料可以提供更为灵活的控制性能和更为丰富的功能。但是现有的改性凝胶材料和细胞进行复合仍然存在一定的困难，特别是用于细胞外基质构建生命仿生模型，在细胞负载效率、细胞负载存活率以及材料性能调控上都存在瓶颈。通常为了提高细胞在凝胶中的负载率而将细胞与凝胶前聚体预混，然后将凝胶通过后续的反应条件，如温度、pH、UV光照、化学催化反应等条件的改变来实现凝固。但是这种条件变化通常会损伤细胞，且用于引发聚合或者参与聚合的成分也可能具有较强的细胞毒性，制约了细胞凝胶复合体的构建效果。也可以先预制备凝胶基质，然后进行后续细胞负载，但由于受到宏观扩散尺寸的限制，细胞的负载通常只能在浅表层，难以满足三维细胞培养的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于是采用微流控技术结合冷冻凝胶制备方法，构建一种天然/合成高分子复合微尺度生物相容性多孔冷冻凝胶微球。该类微凝胶具有均匀一致的尺寸和多孔粗糙结构、超大比较面积、表面性能可调控以及优异的生物相容性和细胞粘附性，可满足对细胞的高密度负载，避免凝胶固化反应物、中间物和环境变化对细胞的毒性，且其较大的孔径结构使得凝胶具有高效的传质效应，有利于细胞的黏附和生长。此外，合成高分子的引入赋予凝胶可调的性能以及智能响应行为等功能。本专利技术的目的之二在于提供该冷冻凝胶微球的制备方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下反应机理：1.明胶改性的反应式：2.水凝胶的合成：为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的技术方案如下：一种生物相容性多孔冷冻凝胶微球，其特征在于该凝胶微球是：利用甲基丙烯酸酐改性后的明胶和树型烷氧醚单体具有相同的丙烯酸官能团，以过硫酸铵为氧化剂，N,N-四甲基乙二胺为催化剂，通过自由基引发链增长的方式，经过微流控液滴发生芯片，得到具有定向多孔结构的生物相容性多孔冷冻凝胶微球，该球的粒径为：5μm-2mm；其固含量为4-20wt％，孔径特征尺寸在0.5～150微米，所述的树型烷氧醚单体和甲基丙烯酸酐改性后的明胶的单体质量比例为5～7：5～3；所述的烷氧醚树形聚合物的结构式为：所述的甲基丙烯酸酐改性后的明胶的结构式为：一种制备上述的生物相容性多孔冷冻凝胶微球，其特征该方法的具体步骤为：a.将树型烷氧醚单体、甲基丙烯酸酐改性后的明胶、氧化剂过硫酸铵、催化剂四甲基按5-7:5-3:0.05:0.05质量比溶于水中，控制固含量为4-20wt％；将各组分配制成溶液。树型烷氧醚单体20％、改性明胶10％、氧化剂过硫酸铵5％、催化剂四甲基乙二胺5％。a.按烷氧醚和改性明胶质量比例为5～7：5～3以及纯改性明胶三个凝胶对应的体积加入模具中制备成预成胶溶液b.将步骤a所得溶液恒温30～40℃，注入微流控液滴发生芯片液体入口；通入挥发性油相HEF7500作为夹流，经过微流控液滴发生芯片，产生冷冻凝胶液滴；该液滴从芯片出口处导出，在流动过程中通过输送管道逐渐冷却到0-10℃收集；c.将步骤b所得液滴冰点以下进一步冷冻交联，保持此温度，交联时间12～96小时，得到凝固的小球；d.将步骤c所得凝固的小球放在室温下，使之恢复到凝胶状态，移除油相，然后用PBS液和水交替清洗小球；最终得到生物相容性多孔冷冻凝胶微球。一种上述的生物相容性多孔冷冻凝胶微球作为细胞基质的应用。本专利技术的具体效果(意义)如下：本专利技术首次实现了具有生物相容性和细胞粘附性的高通量、均一冷冻凝胶微球的制备，实现了对微球结构、成分和化学性能的多重调控。该小球具有多孔粗糙结构，超大比表面积；经过适当的处理，允许在凝胶固化后再进行细胞负载，同时满足高细胞负载和无细胞毒性的需求。此外，通过掺杂烷氧醚温敏聚合物，微球具备了温度智能响应能力，可进一步通过温度实现尺寸和亲疏水性的调控。在先固化的生产方式使这种凝胶微球在应用上更加适合商品化：直接销售的在先固化凝胶微球避免了使用中固化过程的繁琐步骤，简化了细胞负载步骤；其精密的尺寸、孔径、化学组分可控性以及智能响应性，也使其具有比传统材料更好的使用可靠性和更广的适用范围。此外，微凝胶球具有大的比表面积可以更高效的进行物质传输。因此，该种凝胶球作为活细胞3D培养基质、用于构建模拟组织和器官具有明显的优势，是现有商品化细胞外基质的优良替代材料。形成的冷冻凝胶球具有多孔粗糙结构、生物相容性，允许贴壁细胞大量负载，可应用于细胞培养基质和器官模型构建。附图说明图1.冷冻凝胶微球预聚体液滴微流控形成方法。a.一种典型的微流控单水相入口液滴发生器；b.一种典型的微流控双水相入口液滴发生器。图2.调节制备条件形成的冷冻凝胶微球形貌。a-c为三种不同条件下形成典型冷冻凝胶球的形貌，显示可以形成各种尺寸各种形貌的表面粗糙的冷冻凝胶球；d.同一批次形成的大量凝胶微球，显示具有一致的尺寸和形貌特征，具备较好的均匀性。图3.在冷冻凝胶微球上负载3T3细胞形成的高密度细胞团形貌及其活性分析。a.AO-EB染色下细胞团显示绿色(图中白色部分)，显示细胞状态良好，且围绕和嵌入小球，密度较高；b.AO-EB染色下细胞团只有少量红色(图中白色部分)，显示细胞死亡率较低；c.AO-EB染色下细胞的红色、绿色和明场混合图片，显示细胞分布均匀，密度较高，活性良好。具体实施方式下面结合附图和实例对本专利技术作进一步说明。甲基丙烯酸酸酐改性明胶的制备方法请参见：Biomacromolecules2000,1,31-38。树型烷氧醚的合成参照参考文献：Macromolecules,2008,41,3659-3667。实施例1：制备生物相容性的多孔冷冻凝胶微球步骤1.在微流控液滴芯片上制造冷冻凝胶微球预聚体液滴使用图1a所示的芯片，将10％质量分数的GelMA水溶液恒温40℃，注入芯片液体入口；将引发剂过硫酸铵水溶液、TEMED和前述溶液通过两根管道合并成一根管道的结构在通入芯片前进行预混。使用恒温环境使芯片恒温40℃。通入挥发性油相HEF7500(含有2％RANBiotechnology,US生产的EA表面活性剂)作为夹流。控制水相GelMA溶液流速100μL/min,水相引发剂和TEMED混合液流速100μL/min，油相流速200μL/min，经过微流控液滴发生芯片，产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物相容性多孔冷冻凝胶微球，其特征在于该凝胶微球是：利用甲基丙烯酸酐改性后的明胶和树型烷氧醚单体具有相同的丙烯酸官能团，以过硫酸铵为氧化剂，N, N‑四甲基乙二胺为催化剂，通过自由基引发链增长的方式，经过微流控液滴发生芯片，得到具有定向多孔结构的生物相容性多孔冷冻凝胶微球，该球的粒径为：5μm~2mm；其固含量为4‑20wt %，孔径特征尺寸在0.5～150微米，所述的树型烷氧醚单体和甲基丙烯酸酐改性后的明胶的单体质量比例为5～7：5～3；所述的烷氧醚树形聚合物的结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种生物相容性多孔冷冻凝胶微球，其特征在于该凝胶微球是：利用甲基丙烯酸酐改性后的明胶和树型烷氧醚单体具有相同的丙烯酸官能团，以过硫酸铵为氧化剂，N,N-四甲基乙二胺为催化剂，通过自由基引发链增长的方式，经过微流控液滴发生芯片，得到具有定向多孔结构的生物相容性多孔冷冻凝胶微球，该球的粒径为：5μm~2mm；其固含量为4-20wt%，孔径特征尺寸在0.5～150微米，所述的树型烷氧醚单体和甲基丙烯酸酐改性后的明胶的单体质量比例为5～7：5～3；所述的烷氧醚树形聚合物的结构式为：所述的甲基丙烯酸酐改性后的明胶的结构式为：。2.一种制备根据权利要求1所述的生物相容性多孔冷冻凝胶微球，其特征该方法的具体步骤为：将树型烷氧醚单体、甲基丙烯酸酐改性...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文，徐碧漪，陈艳琼，王盈秋，张阿方，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31