多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物及其制备方法和应用，属于生物分离工程技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白混合溶解于水溶性溶剂中获得混合溶液；2)向混合溶液中加入引发剂，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合；3)在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，进行模板洗脱，获得多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物；所述多肽交联剂为氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix‑coil构象转变的多肽。本发明专利技术公开的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物不仅可以在温和的条件下完全去除模板蛋白，而且能够大幅提高蛋白质分子印迹聚合物的印迹效果。

Protein Molecularly Imprinted Polymers Crosslinked by Peptides and Their Preparation and Application

The invention discloses a protein molecularly imprinted polymer crosslinked by a polypeptide and its preparation method and application, belonging to the field of biological separation engineering technology. The method comprises the following steps: 1) dissolving the main monomer, functional monomer, polypeptide crosslinker and template protein in a water-soluble solvent to obtain a mixed solution; 2) adding initiator to the mixed solution, and constructing helix with a polypeptide crosslinker. Polymerization in the presence of image; 3) template elution in the presence of coil conformation in the polypeptide crosslinker to obtain protein molecularly imprinted polymers crosslinked by polypeptide; the polypeptide crosslinker is a polypeptide with double bonds that can be polymerized at both ends of the amino acid sequence and helix coil conformation transformation can occur. The protein molecularly imprinted polymer crosslinked by the polypeptide of the invention can not only completely remove template proteins under mild conditions, but also greatly improve the imprinting effect of the protein molecularly imprinted polymer.

【技术实现步骤摘要】
多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物及其制备方法和应用
本专利技术属于生物分离工程
，尤其涉及多肽交联蛋白质分子印迹聚合物及其制备方法和应用。
技术介绍
分子印迹聚合物是受抗体特异性识别抗原启发而提出的一类人工合成受体。与抗体等天然受体相比，分子印迹聚合物具有制备简单、稳定性好、成本低等优点，在环境、生命等许多领域有重要用途。分子印迹的一般过程为：(1)聚合单体和交联剂在模板分子存在条件下进行聚合，(2)模板洗脱，在聚合物中留下与模板分子在化学和空间上互补的印迹位点，(3)当重新暴露在含有模板分子的溶液中时，印迹聚合物能识别并选择性地重新结合目标分子。小分子印迹聚合物的研究已经取得很大的成功。但是生物大分子印迹，特别是蛋白质的印迹依然困难重重。蛋白质印迹面临的一个首要问题是模板洗脱困难。这是因为蛋白质分子量大，在交联的聚合物网络中扩散困难。目前一般采用一些苛刻的条件进行蛋白模板的洗脱，如用高浓度盐溶液(例如1MNaCl)或醋酸/表面活性剂(SDS或Tween-20)混合溶液(常用配方为10％SDS/10％AcOH)进行洗脱。也有用蛋白水解酶，如胰蛋白酶消化模板蛋白从而除去模板蛋白。这些处理并不能保证模板蛋白的完全去除，且常常导致印迹聚合物网络结构的改变、蛋白质的非特异性吸附、以及印迹位点的阻塞等问题。更重要的是苛刻的洗脱条件极易导致模板蛋白的变性、失活，使得洗脱下来的目标蛋白失去了使用价值，而蛋白水解酶消化的方法更是直接破坏了模板蛋白。蛋白质印迹的很多应用中，例如蛋白的富集、分离和纯化，需要回收有活性的目标蛋白，因此苛刻的洗脱条件使得此类印迹聚合物在很大程度上失去了应用价值。蛋白质印迹面临的第二个严重问题是印迹效果差。蛋白质只溶于水且易变性失活，不能使用在小分子印迹中常使用的有机溶剂，而只能在水溶液中进行印迹。这一方面限制了单体的选择，同时由于水的存在破坏模板和功能单体之间氢键的形成，使得模板与功能单体之间作用力减弱。为了能识别目标分子，必须保持聚合物中印迹位点的大小和空间构型不变，因此在小分子印迹中，聚合物交联度常高达50％以上。然而在蛋白质印迹中，由于模板极难去除，因此只能使用较低的交联度。由于这些原因，现有的蛋白质印迹材料的印迹效果并不理想。例如Chen等公开了一种以溶菌酶为模板蛋白的印迹聚合物，该印迹聚合物以N-异丙基丙烯酰胺为主单体、甲基丙烯酸和丙烯酰胺为功能单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂聚合而成，交联剂含量为3.11mol％。模板蛋白用1MNaCl进行洗脱。印迹容量Qm为350mg/gdrygel，印迹因子仅为1.167(Z.Chen,etal.JournalofMolecularRecognition,2008,21(1),71-77)。对于蛋白质印迹，模板洗脱困难和印迹效果差的问题似乎是其固有的问题，且两个问题相互掣肘，难以同时解决。人们经过长期研究仍未能找到有效的解决方法，使得蛋白质印迹的前景蒙上了阴影(Culver,H.R.；Peppas,N.A.,ChemistryofMaterials,2017,29(14),5753-5761)。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供多肽交联蛋白质分子印迹聚合物及其制备方法和应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：1)将主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白混合溶解于水溶性溶剂中获得混合溶液；2)向步骤1)中所述混合溶液中加入引发剂，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，得到聚合物；3)在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，对步骤2)中所述聚合物进行模板洗脱，获得多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物；所述多肽交联剂为氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix-coil构象转变的多肽。优选的，所述多肽交联剂中氨基酸的数量为2～100个。优选的，所述多肽交联剂中氨基酸的数量为5～30个。优选的，步骤1)中所述的水溶性溶剂包括磷酸缓冲液，Tris缓冲液和NaClO4溶液中的一种。优选的，步骤1)中所述主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白的质量比为(10～30):(0.5～2):(5～20):(5～20)。优选的，所述引发剂选自过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺、过硫酸铵溶液和亚硫酸氢钠、过硫酸钾溶液和四甲基乙二胺以及过硫酸钾溶液和亚硫酸氢钠中的一组。优选的，所述多肽交联剂的构象状态通过圆二色光谱进行检测，当CD谱在222nm、208nm处呈负峰，在190nm±5nm有一正峰时，为helix构象；当CD谱在199nm处呈负峰，220nm±5nm有一正峰时为coil构象。本专利技术提供了所述的制备方法制备获得的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物。本专利技术提供了所述的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物在蛋白质富集、分离和纯化中的应用。优选的，所述多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下，进行目标蛋白的吸附，在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，进行目标蛋白的洗脱。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，用多肽交联剂代替传统的交联剂(例如N,N'-亚甲基双丙烯酰胺)，利用多肽交联剂在不同条件下存在不同构象变化的这一特殊性质，在所述多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，在所述多肽交联剂以coil构象存在的条件下进行模板洗脱。当所述多肽交联剂由helix构象转变为coil构象时，蛋白质分子印迹聚合物发生溶胀，可在温和条件下实现模板蛋白的去除。当所述多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物在应用时，调节外界环境参数，使所述多肽交联剂由coil构象重新转变为helix构象，整个蛋白质分子印迹聚合物发生收缩；更重要的是由于多肽交联剂由coil构象折叠为helix构象时高度专一，蛋白质分子印迹聚合物中的印迹位点在大小和空间构型上能够完全恢复，因此能特异性识别目标蛋白质。本专利技术提供的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物不仅可以在温和的条件下完全去除模板蛋白，而且能够大幅提高了蛋白质分子印迹聚合物的印迹效果。根据实施例1的记载，利用本专利技术所述的方法制备的与文献(Z.Chen,etal.JournalofMolecularRecognition,2008,21(1),71-77)中同样配方的以lysozyme为模板的蛋白质印迹聚合物，交联剂含量仍为3.1mol％，只是将常用的交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺改为实施例1中记载的多肽交联剂。以pH7.4磷酸缓冲溶液(含生理离子强度的NaCl)为洗脱液实现模板蛋白的完全洗脱；蛋白吸附研究结果表明，新合成的印迹聚合物印迹容量Qm为679mg/gdrygel，印迹因子为10.0。参考文献(Z.Chen,etal.JournalofMolecularRecognition,2008,21(1),71-77)的印迹聚合物的最大吸附容量Qm为350mg/gdrygel，印迹因子为1.167。与参考文献相比，多肽交联的印迹聚合物的印迹效果大幅提升。附图说明图1为实施例1中的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物在不同条件下的CD谱，显示多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物中的多肽链段的构象可逆地从h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：1)将主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白混合溶解于水溶性溶剂中获得混合溶液；2)向步骤1)中所述混合溶液中加入引发剂，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，得到聚合物；3)在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，对步骤2)中所述聚合物进行模板洗脱，获得多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物；所述多肽交联剂为氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix‑coil构象转变的多肽。

【技术特征摘要】
1.多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：1)将主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白混合溶解于水溶性溶剂中获得混合溶液；2)向步骤1)中所述混合溶液中加入引发剂，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，得到聚合物；3)在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，对步骤2)中所述聚合物进行模板洗脱，获得多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物；所述多肽交联剂为氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix-coil构象转变的多肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽交联剂中氨基酸的数量为2～100个。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽交联剂中氨基酸的数量为5～30个。4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的水溶性溶剂包括磷酸缓冲液，Tris缓冲液和NaClO4溶液中的一种。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：张拥军，许荣，关英，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12