治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法，包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和溶剂。溶剂可以为富含血小板的脐带血浆或含有人血清白蛋白的注射用PBS。其制备方法为脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个所述脐带动脉旁干细胞，经PBS洗涤两次后，再与溶剂轻轻混匀，获得脐带动脉旁干细胞注射液。该细胞取自医疗废弃物脐带，具有易分离、增殖速度快、免疫原性低的特性。含5％人血清白蛋白的PBS或富含血小板的脐带血浆重悬脐带动脉旁干细胞后制备成注射悬液，悬液注射后显著改善下肢缺血模型小鼠的血流供应。

Injection of paraumbilical artery stem cells for the treatment of ischemic diseases and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法
本专利技术属于药物领域，涉及一种注射液，尤其涉及一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法。
技术介绍
下肢缺血性疾病是一种常见的外周动脉疾病，是指由各种原因导致的下肢动脉狭窄或闭塞、血流灌注不足，从而导致下肢出现间歇性跛行、溃疡、坏疽等缺血表现的一类疾病。目前下肢缺血性疾病的治疗尚未有有效的治疗和控制方法，不足以在广泛的缺血缺氧区域内诱导足够的新生血管的构建。寻找优质的干细胞移植改善缺血下肢的血流灌注是亟待解决的重要问题。目前，人脐带间充质干细胞的研究方面尚有缺陷。主要包括：(1)目前临床应用的主要是脐带华通氏胶间充质干细胞/脐带干细胞混合物，特性不明确，细胞表面CD146表达量低，其血管生成能力较弱。(2)下肢缺血性疾病患者的康复有赖于充分的血供重建，人脐带华通氏胶间充质干细胞在下肢缺血性疾病中的应用疗效不佳。
技术实现思路
本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法，以克服现有技术的缺陷。为实现上述目的，本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和溶剂。进一步，本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，还可以具有这样的特征：其中，溶剂为富含血小板的脐带血浆。进一步，本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，还可以具有这样的特征：其中，脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL。其中，5×106/mL指，1mL溶剂中悬浮5×106个脐带动脉旁干细胞。进一步，本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，还可以具有这样的特征：其中，溶剂为含人血清白蛋白的注射用PBS。进一步，本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，还可以具有这样的特征：其中，脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL，人血清白蛋白的含量为PBS体积的5％。本专利技术还提供上述治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个脐带动脉旁干细胞，经PBS洗涤两次后，再与富含血小板的脐带血浆轻轻混匀，获得脐带动脉旁干细胞注射液。进一步，本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，脐带动脉旁干细胞的制备过程为：足月生产后取新鲜人脐带7-15cm，4h内用含有10％青链双抗和1％肝素的PBS冰上4℃运至实验室；在超净工作台内取出脐带，挤出脐带中的血，PBS反复冲洗直至无血液和血块后，剪刀修齐两断面，沿脐带内血管长轴方向剪开脐带，用镊子钝性分离脐带动脉；将脐带动脉沿与脐带动脉垂直方向剪碎至1-2mm3大小组织块，组织块均匀铺于100mm细胞培养皿底，放置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱内3h；然后缓慢加入5mlDMEM-LG培养基至100mm皿中，轻放置于培养箱中培养；第一周第3天和第7天各加DMEM-LG培养基3ml、2ml，之后第二周半量换液2次，之后第三周全量换液2次，期间观察组织块周围贴壁细胞爬出情况；3周后细胞长到80％融合时去除脐带动脉组织块，0.05％胰酶消化，传代培养；取P3-P5代细胞用于注射悬液制备。进一步，本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，富含血小板的脐带血浆的制备方法为：在50mL离心管中加入750IU肝素钠收集脐带血40mL；在室温下200g低速离心10-15min，收集上层液体；对该上层液体再次2000g高速离心10min，血小板沉积离心管底部，弃去部分上清血浆，留200uL血浆及底部沉积的血小板，轻轻重悬获得富含血小板的脐带血浆(PRP)。进一步，本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，获得的脐带动脉旁干细胞的单细胞悬液，使用不含钙、镁的PBS洗涤2次，然后细胞沉淀采用富含血小板的脐带血浆加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液；脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。本专利技术还提供上述治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个脐带动脉旁干细胞，使用不含钙、镁的PBS洗涤两次，然后细胞沉淀采用含有5％人血清白蛋白的PBS加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液；脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法，脐带动脉旁干细胞不需要借助生长因子，能够体内自发形成类似于血管或脉管系统的芽样或管样结构，同时可以促进血管内皮细胞在体内形成血管样结构。此外，富含血小板脐带血浆(PRP)中存在多种血管生成因子，参与新生血管的生成；PRP中还含有众多能促进干细胞增殖、分化、迁移、黏附的细胞因子和蛋白质。脐带动脉旁干细胞与富含血小板脐带血浆协同作用，效果显著。重悬于富含血小板的脐带血浆的人脐带动脉旁干细胞注射液移植治疗下肢缺血模型小鼠，其缺血下肢血流供应显著改善。附图说明图1a为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigelplugs的vWF、mCD31、hCD31免疫荧光染色图；图1b为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigelplugs的vWF、mCD31、hCD31免疫荧光染色量化统计图；图1c为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigelplugs的mCD31免疫组化染色；图1d为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigelplugs的mCD31免疫组化染色量化统计图；图2a为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液、PBS移植组缺血腓肠肌的mCD31免疫组化染色；图2b为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液、PBS移植组缺血腓肠肌的mCD31免疫组化染色量化统计图；图3a为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液移植组小鼠缺血下肢的多普勒超声血流图；图3b为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液移植组小鼠缺血下肢的血流量化。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和富含血小板的脐带血浆。其中，脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL。治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法为：脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个脐带动脉旁干细胞，使用不含钙、镁的PBS洗涤2次，然后细胞沉淀采用富含血小板的脐带血浆加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液。脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。其中，脐带动脉旁干细胞的制备过程为：足月生产后取新鲜人脐带7-15cm，4h内用含有10％青链双抗和1％肝素的PBS冰上4℃运至实验室；在超净工作台内取出脐带，挤出脐带中的血，PBS反复冲洗直至无血液和血块后，剪刀修齐两断面，沿脐带内血管长轴方向剪开脐带，用镊子钝性分离脐带动脉；将脐带动脉沿与脐带动脉垂直方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和溶剂。

【技术特征摘要】
1.一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和溶剂。2.根据权利要求1所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：其中，所述溶剂为富含血小板的脐带血浆。3.根据权利要求2所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：其中，所述脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL。4.根据权利要求1所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：其中，所述溶剂为含有人血清白蛋白的注射用PBS。5.根据权利要求4所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：其中，所述脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL；人血清白蛋白的含量为PBS体积的5％。6.如权利要求2所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，其特征在于：脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个所述脐带动脉旁干细胞，经PBS洗涤两次后，再与所述富含血小板的脐带血浆轻轻混匀，获得脐带动脉旁干细胞注射液。7.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：其中，所述脐带动脉旁干细胞的制备过程为：足月生产后取新鲜人脐带7-15cm，4h内用含有10％青链双抗和1％肝素的PBS冰上4℃运至实验室；在超净工作台内取出脐带，挤出脐带中的血，PBS反复冲洗直至无血液和血块后，剪刀修齐两断面，沿脐带内血管长轴方向剪开脐带，用镊子钝性分离脐带动脉；将脐带动脉沿与脐带动脉垂直方向剪碎至1-2mm3大小组织块，组织块均匀铺于100mm细胞培养皿底，放置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱内3h；然后缓慢...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁利军，孙海翔，徐璐，李一凡，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32