新颖重组KLOTHO蛋白及其组合物和方法技术

本发明专利技术公开了重组Klotho蛋白、编码其的核酸、表达其的细胞系和培养物、以及其制造和施用方法。蛋白质与人αKlotho的一部分具有至少80％的氨基酸序列同一性并且优选具有溶解度或半衰期延长特征，如糖基化和/或融合蛋白标签。治疗方案包括测定受试者中的Klotho水平，计算足以将受试者中的Klotho水平提高至预定水平的蛋白质的剂量，向受试者施用剂量，确定施用蛋白质后受试者中蛋白质下降的速率，计算蛋白质的后续剂量的时间和/或量，和/或将后续剂量施用于受试者。公开了用于解决衰老相关和其它病况的蛋白质和相关治疗。

Novel recombinant KLOTHO protein and its composition and method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新颖重组KLOTHO蛋白及其组合物和方法
本公开涉及重组人Klotho蛋白组合物作为治疗剂的生产和施用。具体地，本公开涉及包含cGMP级人重组可溶性α-Klotho蛋白或其变体的组合物，以及制备和施用于人或非人受试者的方法。
技术介绍
Klotho(或alpha-Klotho，α-Klotho等)是最近表征的由KL(或klotho)基因编码的蛋白质，位于人13号染色体上。已经鉴定了通过替代RNA剪接从单个klotho基因产生的两个转录物。见图1和2。第一转录被预测编码Klotho同种型1——全长1012个氨基酸、单次跨膜膜蛋白，具有短胞质尾(人残基1003至1012)、跨膜(TM)结构域(人残基982-1002)和细胞外区域或结构域(人残基1-981)，其包含两个同源(内部重复)结构域(称为KL1(人残基56-506，长450个残基)和KL2(人残基515-953，长438个残基)，其各自与β-葡糖苷酶具有20％-40％的氨基酸序列同源性，但可能缺乏类似水平的葡糖苷酶催化活性)和信号序列(SS)结构域(人残基1-33)。含有SS、KL1和KL2结构域的细胞外区域(人残基1-981)可被α/β-分泌酶酶促切割，并作为130kDa循环蛋白释放到循环流中，称为可溶性klotho(或sKlotho、s-Klotho、alpha可溶性-Klotho等)。细胞外区域也可以切割成单独的68kDa蛋白质(KL1+SS)和64kDa蛋白质(KL2)。第二个转录物是α-klothomRNA的剪接变体，编码Klotho蛋白的第二个同种型，主要对应于KL1结构域。认为内部剪接供体位点位于klotho基因的外显子3中。得到的可变剪接转录物在外显子3(图1；灰色)后含有50bp插入，在其末端具有符合读框的终止密码子。表达的蛋白质产物分泌到循环中并称为分泌的Klotho(或Klotho同种型2)，其与同种型1的典型序列在氨基酸残基535-549不同：DTTLSQFTDLNVYLW→SQLTKPISSLTKPYH，并且有氨基酸残基550-1012缺失。因此，在任何给定时间，在循环中可能存在许多不同的Klotho蛋白，这取决于基因表达、RNA剪接和酶促切割。尽管存在各种形式的α-Klotho蛋白，但已知只有全长、膜结合的同种型1与成纤维细胞生长因子(FGF)受体形成复合物，并且用作FGF23的必需共受体——骨来源激素，其诱导尿液排出磷酸盐并对Pi和维生素D代谢具有调节作用。Klotho在肾脏、大脑中以及在其他器官中的较小程度上高度表达，并且也可以在哺乳动物的脑脊髓液和尿液中发现。哺乳动物中可溶性Klotho蛋白的循环水平被认为随着年龄而降低。此外，Klotho缺陷小鼠表现出加速的衰老表型，而小鼠中klotho的过表达已显示延长寿命。此外，Klotho还涉及许多与衰老相关的细胞过程。鉴于上述情况，发展中的假设认为可溶性Klotho可以在人体中起抗衰老化合物的作用。衰老是一种不可避免的渐进式生物过程，导致几乎所有组织和器官的功能障碍和破坏，最终导致死亡。例如，人体的衰老与细胞功能的衰退有关，这可导致各种疾病的发展。衰老被认为是由遗传和获得因素之间严格调节和复杂的相互作用驱动的，其特征通常在于衰老的增加、干细胞的定量和定性降低以及组织水平的异常结构。随着所谓的“婴儿潮一代”一代人在年龄上不断发展，老龄人(例如，年龄在60-65岁)的人口在全球范围内迅速增加。这一老龄化人口对医疗保健需求的增加给任何医疗保健系统带来了巨大的经济负担。重组klotho蛋白可以提供有希望的治疗剂以对抗与年龄相关的健康状况。基于可溶性Klotho的生产和纯化(例如，基本同质性)开发策略和健康干预方法以及在日益老化的人群中向受试者施用该蛋白质可有助于改善这种情况和与之相关的问题。目前，不存在用于提供人Klotho蛋白质的外源形式的方法，如重组可溶性人α-Klotho蛋白质或蛋白质变体，特别是作为现行良好制造规范(cGMP)的规定标准的蛋白质，如由美国食品和药物管理局(FDA)确定和强制执行的，无论是单独使用还是与一种或多种其他活性成分组合使用。迄今为止，与Klotho相关的所有相关治疗数据都是动物模型中的临床前研究试验。基于对受试者，尤其是人类和/或在日益老龄化的人群中施用重组S-Klotho发展策略和健康干预方法可能有助于改善这种情况。
技术实现思路
本公开的实施方案利用重组人Klotho蛋白、蛋白质片段和/或蛋白质变体、表达核酸构建体和/或载体、细胞系和/或细胞悬浮液，以及其制备、纯化和施用其至(人或非人动物)受试者的方法，解决了一个或多个上述或本领域中的其他问题。例如，本公开的一些实施方案可以包括以下中的一种或多种：重组人α可溶性Klotho蛋白、蛋白片段和/或蛋白质变体；组合物(例如，治疗组合物、药物组合物、药剂、制剂)等，其包括重组人α可溶性Klotho蛋白；组合物，其包括重组人α可溶性Klotho蛋白和(药学上可接受的)媒介物(例如，载体或赋形剂)；组合物，其包括重组人α可溶性Klotho蛋白和至少一种额外(活性)成分；编码重组人α可溶性Klotho蛋白的核酸构建体或载体；细胞系，其含有(i)编码重组人α可溶性Klotho蛋白的核酸构建体或载体和/或(ii)表达重组人α可溶性Klotho蛋白；细胞的细胞悬浮培养物，其含有(i)编码重组人α可溶性Klotho蛋白的核酸构建体或载体和/或(ii)表达重组人α可溶性Klotho蛋白；一种制备和任选纯化重组人α可溶性Klotho蛋白的方法；一种制备重组人α可溶性Klotho蛋白的药剂(或治疗组合物，即制剂)的方法；将重组人α可溶性Klotho蛋白质施用至(人或非人动物)受试者的方法；用于确定受试者中Klotho蛋白缺乏的诊断方法；一种诊断受试者中Klotho蛋白缺乏的方法；一种诊断受试者需要通过施用接受重组人α可溶性Klotho蛋白的方法；用于评估有效性和/或确定蛋白质对有需要的受试者的有效剂量的方法；重组人α可溶性Klotho蛋白，用于治疗人类或非人类动物(例如，非人类哺乳动物)的特定的医学或其它病况；重组人α可溶性Klotho蛋白的用途，其用于治疗人类或非人类动物的特定的医学或其它病况；包括重组人α可溶性Klotho蛋白的组合物的用途，其用于治疗人类或非人类动物的特定的医学或其它病况；和/或重组人α可溶性Klotho蛋白质在制备用于治疗人类或非人类动物的特定的医学或其它病况的药剂中的用途。一些实施方案可包括制备重组Klotho蛋白的方法，该方法包括在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生重组Klotho蛋白，优选在二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞中，更优选在CHO-S细胞中，或优选在谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型CHO细胞中，更优选在GS-/-CHO细胞中，所述蛋白质优选地与SEQIDNO:2至SEQIDNO:70或SEQIDNO:107至SEQIDNO:120的一种的至少一部分具有至少80％氨基酸序列同一性。一些实施方案可以包括一种细胞系，其包括多个中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，优选在二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞，更优选在CHO-S细胞，或优选地在谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型CHO细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗和/或预防哺乳动物受试者的急性肾损伤或慢性肾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包括：药学上可接受的载体或赋形剂；和有效量的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括：与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:109之一具有至少85％氨基酸序列同一性的Klotho蛋白质序列；和选自由以下组成的群组的一种或多种合成蛋白质序列：免疫球蛋白Fc结构域的至少一部分；和蛋白酶识别序列的至少一部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.22 US 62/425,237;2017.02.08 US 62/456,3181.一种治疗和/或预防哺乳动物受试者的急性肾损伤或慢性肾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包括：药学上可接受的载体或赋形剂；和有效量的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括：与SEQIDNO:4、SEQIDNO:9和SEQIDNO:109之一具有至少85％氨基酸序列同一性的Klotho蛋白质序列；和选自由以下组成的群组的一种或多种合成蛋白质序列：免疫球蛋白Fc结构域的至少一部分；和蛋白酶识别序列的至少一部分。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述急性肾损伤选自由以下组成的群组：(i)手术或其它医疗程序诱导的肾损伤，优选肾手术诱导的肾损伤，更优选肾移植诱导的肾损伤；(ii)脓毒病诱导的肾损伤；(iii)肾脏缺血，优选手术或其它医疗程序诱导的肾脏缺血，更优选：肾手术诱导的肾脏缺血，优选肾移植诱导的肾脏缺血；和/或心血管手术诱导的肾脏缺血，优选主动脉修复、动脉瘤修复或心脏手术诱导的肾脏缺血、心脏旁路手术诱导的肾脏缺血、冠状动脉旁路(移植)手术诱导的肾脏缺血和/或心肺旁路手术诱导的肾脏缺血；和/或(iv)肾毒性，优选药物诱导的肾毒性，更优选抗微生物剂诱导的肾毒性或氨基糖苷类诱导的肾毒性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述施用步骤包括以下中的一个或多个：推注或渐进注射，优选选自静脉内、真皮内、腹膜内、肌肉内、皮内和皮下注射；口服或口服相关的施用，优选选自摄入、经颊和舌下施用；局部施用；经皮施用；直肠施用；阴道施用；和吸入。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其进一步包括：测量所述受试者的体液中的可溶性Klotho蛋白的浓度；和计算所述组合物的足以提高所述可溶性Klotho蛋白浓度至少至预定水平和/或持续预定时间段的第一剂量，所述施用的组合物包括所述第一剂量。5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括：测量在所述施用步骤之后所述受试者的体液中的可溶性Klotho蛋白浓度下降的速率；计算所述组合物的后续剂量的时间和/或量；和根据所述计算的时间和/或量，向所述受试者施用所述组合物的所述后续剂量。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中每个施用步骤足以提高和/或维持所述受试者的所述体液中的可溶性Klotho蛋白的浓度至少至预定水平和/或持续预定时间段。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述预定水平大约大于、等于和/或在以下之间：每毫升所述体液50、100、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,00020,000、25,000、30,00040,000、50,000、75,000和/或100,000皮克可溶性Klotho蛋白；所述受试者的每公斤体重0.0001-10mg、所述受试者的每公斤体重0.0001-10μg、所述受试者的每公斤体重0.0001-10ng、所述受试者的每公斤体重0.0001-10pg；或比所述受试者的所述体液中的已知典型健康水平的可溶性Klotho蛋白高5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、1200％、1500％、2000％、2500％、3000％、4000％或5000％。8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述预定时间段大于、等于或介于约6小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、14天、21天或30天之间。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中施用所述蛋白质：预防性地，在肾手术、肾移植、心血管手术、心脏旁路手术、冠状动脉旁路(移植)手术、心肺旁路手术和施用肾毒素中的一个或多个之前；和/或在肾手术、肾移植、心血管手术、心脏旁路手术、冠状动脉旁路(移植)手术、心肺旁路手术和施用肾毒素中的一个或多个之后。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肾毒素包括：一种或多种氨基糖苷类，优选选自由以下组成的群组：巴龙霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素和新霉素；一种或多种非类固醇抗炎药(NSAID)，优选选自由以下组成的群组：阿司匹林(乙酰水杨酸)、塞来昔布、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、萘丁酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、双水杨酸酯、舒林酸和托美汀；一种或多种抗微生物剂，优选选自由以下组成的群组：青霉素、氨苄青霉素、头孢菌素、磺胺、环丙沙星、万古霉素、大环内酯、四环素和利福平；一种或多种抗真菌剂，优选选自由以下组成的群组：两性霉素B和氟胞嘧啶；一种或多种造影剂，优选选自由以下组成的群组：碘化的放射性造影介质、碘与分子比为约1.5:1的高渗透压造影介质(HOCM)、碘与分子比为约3:1的低渗透压非离子造影介质(LOCM)和碘与分子比为约6:1的等渗(等渗透性)造影介质(IOCM)；一种或多种抗逆转录病毒剂，优选选自由以下组成的群组：阿德福韦、西多福韦、替诺福韦和膦甲酸；一种或多种癌症(或化疗)治疗剂，优选选自由以下组成的群组：顺铂、卡铂、奥沙利铂、烷化剂、苯达莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、替莫唑胺、美法仑、抗肿瘤抗生素、丝裂霉素C、博来霉素、蒽环霉素、抗代谢物、卡培他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、普拉曲沙、喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、长春花生物碱、拓扑替康、依托泊苷、紫杉烷、伊立替康、来那度胺、艾日布林、三氧化二砷或伊沙唑嗪；一种或多种二膦酸盐或其衍生物，优选选自由以下组成的群组：唑来膦酸盐/唑来膦酸、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、阿仑膦酸盐/胆钙化醇、依替膦酸盐、利塞膦酸盐、利塞膦酸盐碳酸钙、帕米膦酸盐和替鲁膦酸盐；一种或多种环加氧酶-2(COX-2)抑制剂，优选选自由以下组成的群组：伐地考昔、罗非考昔和塞来昔布；一种或多种质子泵抑制剂，优选选自由以下组成的群组：奥美拉唑和兰索拉唑；一种或多种抗惊厥剂，优选选自由以下组成的群组：苯妥英和丙戊酸；一种或多种组胺H2受体拮抗剂，优选选自由以下组成的群组：尼扎替丁、雷尼替丁、法莫替丁和西咪替丁；一种或多种利尿剂，优选选自由以下组成的群组：帕马溴、甘露醇、碳酸酐酶抑制剂、袢利尿剂、优选布美他尼、乙基丙烯酸或托拉塞米、呋塞米、保钾利尿剂、优选三氨苯蝶啶、螺内酯或阿米洛利、或噻嗪利尿剂、优选吲达帕胺、氯噻酮、美托拉宗、甲氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻嗪、苄氟噻嗪、多噻嗪和氢氟噻嗪；一种或多种麻醉剂或阿片类药物，优选选自由以下组成的群组：可卡因和海洛因；一种或多种元素或元素金属，优选选自由以下组成的群组：锂、金、铜和汞；一种或多种直接-作用平滑肌松弛剂，优选肼苯哒嗪；一种或多种解痉剂，优选选自由以下组成的群组：卡立普多、环苯扎林、美他沙酮、美索巴莫、地西泮、可乐定、替扎尼定、巴氯芬、丹曲林、咪唑啉化合物、苯并二氮杂卓和乙内酰脲衍生物；和一种或多种重金属毒性药物、免疫抑制剂或螯合药物，优选(D-)青霉胺。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述Klotho蛋白质序列相对于SEQIDNO:1包括以下中的一个或多个：F45、V45、C370、S370、F352、除V352以外、H193和除R193以外。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述Klotho蛋白质序列与SEQIDNO:4、SEQIDNO:9和SEQIDNO:109之一具有至少88％、90％、92％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中以下中的一个或多个：所述免疫球蛋白Fc结构域序列的所述至少一部分与SEQIDNO:74的至少一部分具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性；和所...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫·F·塔西奥，迪内希·拉图里，詹姆斯·R·普兰特，
申请(专利权)人：克洛索治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US