一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行灵芝菌种保护的方法技术

本发明专利技术属于菌种保护技术领域，涉及一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行灵芝菌种保护的方法，所述方法包括如下步骤：将灵芝尿嘧啶营养缺陷型单核体80‑3与灵芝单核体野生型菌株杂交，出菇后单孢分离获得单核体菌株；筛选所得单核体菌株，得到尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株；将所得尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株进行单单杂交，培养后得到灵芝尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。所得灵芝尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株在添加尿嘧啶的PDA培养基上生长速度相对于在PDA培养基上生长速度提高了97.5％，在不含尿嘧啶添加物的基本培养基中无法正常生长，可以对灵芝菌种进行有效地保护。

A Method of Protecting Ganoderma lucidum Strains by Utilizing Uracil Nutrition Deficiency Type

【技术实现步骤摘要】
一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行灵芝菌种保护的方法
本专利技术属于菌种保护
，涉及一种灵芝菌种保护的方法，具体涉及一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行灵芝菌种保护的方法。
技术介绍
灵芝是中国传统的食药用菌，含有灵芝多糖、三萜类化合物、核苷类、氨基酸、麦角甾醇、生物碱等多种生物活性成分。对灵芝的药理学和临床应用等多方面的研究证实，灵芝多糖具有降血糖、促进肠道粘膜免疫系统的免疫功能、延缓衰老、保肝、促进睡眠等功效。灵芝栽培与生产的发展依赖菌种，灵芝菌种的选育需要依靠长期的积累，需要投入大量的人力、物理与时间成本，但灵芝为无性繁殖，其菌种生产工艺具有可复制性，从而使得灵芝菌种容易被仿冒。营养缺陷型菌种由于基因发生突变丧失了合成某种物质的能力，在基本培养基中无法正常生长，必须补充某些营养物质才可以正产生长。如果无法明确知道究竟是何种营养缺陷，其生产会受到极大限制，从而使育种者的知识产权得到充分的保护。灵芝作为食药用真菌采用营养缺陷标记具有更高的安全性。尿嘧啶营养缺陷型是一种在微生物中常用的标记。5-氟乳清酸是尿嘧啶合成途径中乳清酸核苷酸的底物类似物，能转化为有很强细胞毒性的5-氟尿嘧啶核苷酸，从而抑制野生型菌株的生长。而尿嘧啶营养缺陷型菌株因尿嘧啶的合成途径被打断，不能代谢产生有毒的5-氟尿嘧啶核苷酸，因此不能获得5-氟乳清酸抗性。CN107557354A公开了一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行杏鲍菇菌种保护的方法，CN105802952A公开了一种利用尿嘧啶营养缺陷型晶型香菇菌种保护的方法，CN106978413A公开了一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行金针菇菌种保护的方法，这些方法虽然对杏鲍菇、香菇与金针菇进行了菌种保护，但现有技术中没有对灵芝菌种保护的方法进行研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用尿嘧啶营养缺陷进行灵芝菌种保护的方法，该方法简单，成本低，得到的灵芝尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株在不含有尿嘧啶添加物的培养基中无法正常生长，从而实现了对灵芝菌种的保护。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行灵芝菌种保护的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将灵芝尿嘧啶营养缺陷型单核体80-3与灵芝单核体野生型菌株杂交，出菇后单孢分离获得单核体菌株；(2)筛选步骤(1)所得单核体菌株，得到尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株；(3)将步骤(2)所得尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株进行单单杂交，培养后得到灵芝尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。所述灵芝尿嘧啶营养缺陷型单核体80-3的保藏编号为：CGMCCNO.12879，保藏日期为：2016年9月19日，分类名称为灵芝(Ganodermalucidum)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株的保藏编号为：CGMCCNO.16098，保藏日期为：2018年8月24日，分类名称为灵芝(Ganodermalucidum)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。优选地，步骤(1)所述出菇在木屑培养基上进行。本专利技术所述木屑培养基由78wt.％的木屑、20wt.％的麦麸、1wt.％的石膏以及1wt.％的蔗糖组成，混合而成的木屑培养基的含水量为60-65％，木屑培养基装袋灭菌后供出菇使用。优选地，步骤(1)所述单孢分离的步骤为：(a)收集出菇后子实体单株自然弹射的孢子，将孢子在无菌水中浸泡后稀释，得到分散液；(b)分散液涂布在原生质体再生筛选培养基，培养后将萌发孢子转接到添加尿嘧啶的PDA培养基上，再培养后挑选边缘菌丝，并将边缘菌丝于新的添加尿嘧啶的PDA培养基上进行培养，重复再培养4-6次后得到单核体菌株。本专利技术所述原生质体再生筛选培养基为在PDA培养基中添加尿嘧啶与5-氟乳清酸得到的培养基，其中，原生质体再生筛选培养基中尿嘧啶的浓度为0.05mmol/L，5-氟乳清酸的浓度为0.5g/L。本专利技术所述添加尿嘧啶的PDA培养基为在PDA培养基中添加尿嘧啶得到的培养基，添加尿嘧啶的PDA培养基中尿嘧啶的浓度为0.1mmol/L。本专利技术步骤(b)中所述培养的温度为20-28℃，培养的时间为14-16d，所述在培养的温度为20-28℃，再培养的时间为6-8d。优选地，所述PDA培养基为由以下步骤制备得到的PDA培养基：39gPDA粉末与无菌水混合后定容至1L，灭菌后倒平板，得到所述PDA培养基。本专利技术所述PDA粉末为BD公司生产的型号为CND07-F0185的马铃薯葡萄糖琼脂。优选地，步骤(a)所述稀释为使用无菌水稀释，所得孢子液中孢子的浓度为1×104个/mL。优选地，步骤(2)所述筛选的步骤为：将步骤(1)所得单核体菌株分别独立地接种于基本培养基、添加尿嘧啶基本培养基与筛选培养基中，能够在添加尿嘧啶基本培养基与筛选培养基中生长，但在基本培养基中不生长的单核体菌株即为所述尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株。优选地，步骤(3)所述杂交在添加尿嘧啶的基本培养基上进行。优选地，所述基本培养基为由以下步骤制备得到的基本培养基：混合葡萄糖、KH2PO3、(NH4)2HPO3、MgSO4·7H2O、ThiamineHCl、琼脂粉与水，加水至1L，灭菌后倒平板得到所述基本培养基。本专利技术所述基本培养基为由葡萄糖、KH2PO3、(NH4)2HPO3、MgSO4·7H2O、ThiamineHCl、琼脂粉与水组成的培养基，其中每1L基本培养基中含有20g葡萄糖，1gKH2PO3，1.5g(NH4)2HPO3，0.3gMgSO4·7H2O，500μgThiamineHCl，15g琼脂粉，余量为水。本专利技术所述添加尿嘧啶的基本培养基为在基本培养基中添加尿嘧啶得到的培养基，所述添加尿嘧啶的基本培养基中尿嘧啶的浓度为0.05mmol/L。本专利技术所述筛选培养基为在基本培养基中添加尿嘧啶与5-氟乳清酸得到的培养基，其中筛选培养基中尿嘧啶的浓度为0.05mmol/L，5-氟乳清酸的浓度为0.5g/L。作为本专利技术提供方法的优选技术方案，所述方法包括如下步骤：(1)将灵芝尿嘧啶营养缺陷型单核体80-3与灵芝单核体野生型菌株杂交，木屑培养基上出菇，收集出菇后子实体单株自然弹射的孢子，将孢子在无菌水中浸泡后稀释至1×104个/mL，得到分散液，分散液涂布在原生质体再生筛选培养基，培养后将萌发孢子转接到添加尿嘧啶的PDA培养基上，再培养后挑选边缘菌丝，并将边缘菌丝于新的添加尿嘧啶的PDA培养基上进行再培养，重复再培养4-6次后得到单核体菌株；(2)将步骤(1)所得单核体菌株分别独立地接种于基本培养基、添加尿嘧啶基本培养基与筛选培养基中，能够在添加尿嘧啶的基本培养基与筛选培养基中生长，但在基本培养基中不生长的单核体菌株即为所述尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株；(3)将步骤(2)所得尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株在添加尿嘧啶基本培养基上进行单单杂交，培养后得到灵芝尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的方法简单，成本低，灵芝尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株在添加尿嘧啶的PDA培养基上生长速度相对于在PDA培养基上生长速度提高了97.5％，在不含有尿嘧啶添加物的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行灵芝菌种保护的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将灵芝尿嘧啶营养缺陷型单核体80‑3与灵芝单核体野生型菌株杂交，出菇后单孢分离获得单核体菌株；(2)筛选步骤(1)所得单核体菌株，得到尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株；(3)将步骤(2)所得尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株进行单单杂交，培养后得到灵芝尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株；所述灵芝尿嘧啶营养缺陷型单核体80‑3的保藏编号为：CGMCC NO.12879，保藏日期为：2016年9月19日；所述尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株的保藏编号为：CGMCC NO.16098，保藏日期为：2018年8月24日。

【技术特征摘要】
1.一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行灵芝菌种保护的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将灵芝尿嘧啶营养缺陷型单核体80-3与灵芝单核体野生型菌株杂交，出菇后单孢分离获得单核体菌株；(2)筛选步骤(1)所得单核体菌株，得到尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株；(3)将步骤(2)所得尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株进行单单杂交，培养后得到灵芝尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株；所述灵芝尿嘧啶营养缺陷型单核体80-3的保藏编号为：CGMCCNO.12879，保藏日期为：2016年9月19日；所述尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株的保藏编号为：CGMCCNO.16098，保藏日期为：2018年8月24日。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述出菇在木屑培养基上进行。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述单孢分离的步骤为：(a)收集出菇后子实体单株自然弹射的孢子，将孢子在无菌水中浸泡后稀释，得到分散液；(b)分散液涂布在原生质体再生筛选培养基，培养后将萌发孢子转接到添加尿嘧啶的PDA培养基上，再培养后挑选边缘菌丝，并将边缘菌丝于新的添加尿嘧啶的PDA培养基上进行再培养，重复再培养4-6次后得到单核体菌株。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PDA培养基为由以下步骤制备得到的PDA培养基：39gPDA粉末与无菌水混合后定容至1L，灭菌后倒平板，得到所述PDA培养基。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)...

【专利技术属性】
技术研发人员：周陈力，鲍大鹏，王晨光，万佳宁，茅文俊，李燕，吴莹莹，陈洪雨，王莹，杨瑞恒，
申请(专利权)人：上海百信生物科技有限公司，上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31