一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法技术

本发明专利技术提供了一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，该方法包括如下步骤：(1)灵芝子实体的预处理步骤；(2)超高效液相色谱检测步骤；(3)化合物质谱信息获得步骤；(4)超高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法


[0001]本专利技术涉及食品药品分析领域，具体是建立精确测定灵芝子实体、提取物及相关产品中三萜类成分的分析方法。

技术介绍

[0002]三萜类化合物是灵芝(Ganoderma sp.)中一类重要的活性成分，被认为是灵芝具有抗肿瘤、抗病毒、保护肝脏、抗氧化等诸多应用价值的物质基础。三萜类化合物是一类高度氧化的四环三萜，根据官能团的不同，可以分为灵芝酸、灵芝烯酸、赤芝酸、灵芝醛、灵芝酮、灵芝醇等，其中，在灵芝中含量较高的灵芝酸和灵芝烯酸化合物有灵芝酸L(Ganoderic acid L)，灵芝酸I(Ganoderic acid I)，灵芝烯酸C(Ganoderenic acid C)，灵芝酸C2(Ganoderic acid C2)，灵芝酸C6(Ganoderic acid C6)，灵芝酸G(Ganoderic acid G)，灵芝烯酸B(Ganoderenic acid B)，灵芝酸N(Ganoderic acid N)，灵芝酸B(Ganoderic acid B)，灵芝酸LM2(Ganoderic acid LM2)，灵芝烯酸A(Ganoderenic acid A)，灵芝酸K(Ganoderic acid K)，灵芝烯酸E(Ganoderenic acid E)，灵芝酸A(Ganoderic acid A)，灵芝酸H(Ganoderic acid H)，赤芝酸A(Lucidenic acid A)，灵芝烯酸D(Ganoderenic acid D)，灵芝酸D(Ganoderic acid D)，灵芝酸Z(Ganoderic acid Z)，灵芝酸F(Ganoderic acid F)，灵芝酸SZ(Ganoderic acid SZ)，灵芝酸DM(Ganoderic acid DM)，灵芝酸Jb(Ganoderic acid Jb)，灵芝酸AM1(Ganoderic acid AM1)，灵芝酸Y(Ganoderic acid Y)等。由于灵芝中单个三萜化合物的含量较少，制备困难，成本也较高，通常把灵芝子实体整体或者其提取物作为保健食品或药品的原料来源。因此，有必要建立一种精准的分析方法，对灵芝子实体、提取物或相关产品中的三萜化合物进行测定。
[0003]以往学者们多用化学法或高效液相-紫外检测法对灵芝中三萜进行定量。而市场上关于灵芝子实体为原料来源的保健品和药品，也大多以化学法检测三萜含量作为产品指标。事实上，无论是化学法，还是高效液相-紫外检测法，都存在缺陷。这是因为，灵芝中不只有灵芝酸这类三萜化合物，还有多种甾醇类化合物和不饱和脂肪酸类物质也能和香草醛-冰醋酸以及高氯酸发生反应，影响化学法测定的结果。而高效液相-紫外检测法也存在一定缺陷，因为该方法只能通过保留时间对三萜化合物进行定性，但由于灵芝子实体中三萜化合物过于复杂多样，很多三萜化合物具有相同的保留时间，很难通过洗脱条件优化和色谱柱的选择将其分离开来。因此，对于灵芝子实体中复杂多样的三萜，急需一种精确的定性定量检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，该方法包括如下步骤：
[0005](1)灵芝子实体的预处理步骤：将灵芝子实体样品加入有机溶剂进行提取，取上清液，过滤，稀释，得到待测样品溶液；配制25个三萜化合物的混合标准品溶液；
[0006](2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和25个三萜化合物的混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
[0007](3)化合物质谱信息获得步骤：利用质谱优化软件(Agilent Optimizer)，对25个三萜化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；
[0008](4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤：在数据采集软件(Agilent MassHunter Data Acquisition)中，在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下，导入保留时间，母离子、子离子对，建立25个三萜化合物的动态多反应监测(DMRM)分析测定方法；同时，对不同浓度的混合标准品溶液和待测样品溶液进行上样测定；
[0009](5)数据分析步骤：运用定量分析软件(Agilent MassHunter Quantitative Analysis)，创建25个三萜化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝子实体待测样品溶液进行定量分析。
[0010]其中步骤(1)中灵芝子实体的预处理步骤中：
[0011]所用浸提液为甲醇、乙醇中的一种，优选甲醇；
[0012]提取方法为超声提取或60℃加热提取，优选超声提取；
[0013]提取时间为10-90min，优选60min；料液比为1∶20
--
1∶40，优选1∶30(重量g∶体积mL)；
[0014]浸提次数包括一次性浸提或反复浸提，优选1次；
[0015]取浸提上清液，用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤，然后用质谱级甲醇稀释20倍即获得进样用待测样品溶液；
[0016]其中步骤(1)中25个三萜化合物标准品溶液的配制方法为，分别精密称取：Ganoderic acid L(C
30
H
46
O8，化合物1)，Ganoderic acid I(C
30
H
44
O8化合物2)，Ganoderenic acid C(C
30
H
44
O7，化合物3)，Ganoderic acid C2(C
30
H
46
O7，化合物4)，Ganoderic acid C6(C
30
H
42
O8，化合物5)，Ganoderic acid G(C
30
H
44
O8，化合物6)，Ganoderenic acid B(C
30
H
42
O7，化合物7)，Ganoderic acid N(C
30
H
42
O8，化合物8)，Ganoderic acid B(C
30
H
44
O7，化合物9)，Ganoderic acid LM2(C
30
H
42
O7，化合物10)，Ganoderenic acid A(C
30
H
42
O7化合物11)，Ganoderic acid K(C
32
H
46
O9，化合物12)，Ganoderenic acid E(C
30
H
40
O8，化合物13)，Ganoderic acid A(C
30
H
44
O7化合物14)，Ganoderic acid本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)灵芝子实体的预处理步骤：将灵芝子实体样品加入有机溶剂进行提取，取上清液，过滤，稀释，得到待测样品溶液；配制25个三萜化合物的混合标准品溶液；(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和25个三萜化合物的混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；(3)化合物质谱信息获得步骤：利用质谱优化软件Agilent Optimizer，对25个三萜化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤：在数据采集软件Agilent MassHunter Data Acquisition中，在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下，导入保留时间，母离子、子离子对，建立25个三萜化合物的动态多反应监测DMRM分析测定方法；同时，对不同浓度的混合标准品溶液和待测样品溶液进行上样测定；(5)数据分析步骤：运用定量分析软件Agilent MassHunter Quantitative Analysis，创建25个三萜化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝子实体待测样品溶液进行定量分析。2.根据权利要求1所述的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其中步骤(1)中灵芝子实体的预处理步骤中：所用浸提液为甲醇或乙醇中的一种；提取方法为超声提取或60℃加热提取；提取时间为10-90min；料液比为1∶20
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1∶40，重量体积比，重量g：体积ml；取浸提上清液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤，然后用质谱级甲醇稀释20倍即获得进样用待测样品溶液。3.根据权利要求1所述的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其中步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，1.8μm，2.1
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150mm，检测波长：254nm。柱温：35℃。上样量为2uL。流速：0.4mL/min。流动相：0.01％醋酸水(A)-乙腈(B)。洗脱程序：0min，74％A，26％B；18min，73％A，27％B；28min，65％A，35％B；31min，40％A，60％B；36min，10％A，90％B；40min，0％A，100％B；44min，74％A，26％B。4.根据权利要求1所述的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其中通过质谱优化软件Agilent Optimizer，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：Ganoderic acid L，保留时间：5.86min；母离子：533；定量离子：489.2，碰撞能：17；定性离子：287.2，碰撞能37；Ganoderic acid I，保留时间：7.81min；母离子：531；定量离子：401.2，碰撞能：13；定性离子：128.9，碰撞能33；Ganoderenic acid C，保留时间：10.01min；母离子：515；定量离子：193，碰撞能：21；定性离子：79，碰撞能33；Ganoderic acid C2，保留时间：11.65min；母离子：517；定量离子：499.2，碰撞能：33；定性离子：287.2，碰撞能37；
Ganoderic acid C6，保留时间：14.04min；母离子：529；定量离子：511.2，碰撞能：13；定性离子：467.3，碰撞能37；Ganoderic acid G，保留时间：16.07min；母离子：531；定量离子：513.1，碰撞能：17；定性离子：265.1，碰撞能41；Ganoderenic acid B，保留时间：16.82min；母离子：513；定量离子：495.2，碰撞能：17；定性离子：451.1，碰撞能33；Ganoderic acid N，保留时间：17.78min；母离子：529；定量离子：511.3，碰撞能：13；定性离子：129，碰撞能17；Ga...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯娜，张劲松，唐庆九，王晨光，岳亚文，程池露，周帅，王金艳，周靖，方英，
申请(专利权)人：上海百信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：