一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法技术

本发明专利技术提供了一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法，该方法包括以下步骤：液体菌种的制备，菌丝体悬浮液的制备，菌丝体包埋小球的制备，菌丝体包埋小球的保存。本发明专利技术采用特定的保存剂将双孢菇液体菌种制备成悬浮液，再通过包埋载体将其固定化制备成包埋小球，能够有效延长双孢菇液体菌种的保存时间，保证菌种的存活率以及复苏后的活性，降低污染风险。使用本发明专利技术的方法在0~4℃可保存双孢菇菌种3年，在‑30~‑20℃可保存双孢菇菌种5年，保存时间长，适用范围广，菌种成活率高，保存效果好，并且还具有携带方便、便于运输的优点。

An Immobilized Preservation Method for Liquid Mushroom of Agaricus bisporus

【技术实现步骤摘要】
一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法
本专利技术属于食用菌菌种保藏
，具体涉及一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法。
技术介绍
双孢菇（学名：Agaricusbisporus）属于担子菌亚门、伞菌目、伞菌科、蘑菇属，又称双孢蘑菇、白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是世界上栽培面积最大，产量最多，消费最普遍的一种食用菌。双孢菇属草腐菌，中低温性菇类，其菌丝体为银白色，生长速度中偏快，子实体为白色或乳白色，菌盖厚实，呈半圆形。双孢菇具有很高的食用价值，其菌肉肥嫩，味道鲜美，营养丰富。据测定每100克鲜品中含蛋白质2.9g、脂肪0.2g、碳水化合物2.4g、粗纤维0.6g、灰分0.6g、钙8毫克、磷66mg、铁1.3mg、维生素B10.11mg，维生素B20.16mg、维生素C4mg、烟酸3.3mg。双孢菇中蛋白质含量约占35%-38%，几乎高于所有的豆类和蔬菜，有“植物肉”的美称。此外双孢菇中含有18种氨基酸，其中6种为人体必需氨基酸，并且还含有大量的维生素，其营养价值是蔬菜和水果的4-12倍，因此还享有“素中之王”的美称。双孢菇还具有一定的药用和保健功效。双孢菇所含的蘑菇多糖和异蛋白具有一定的抗癌活性，可抑制肿瘤的发生；所含的酪氨酸酶能溶解一定的胆固醇，对降低血压有一定作用；所含的胰蛋白酶、麦芽糖酶等均有助于食物的消化。中医认为双孢菇味甘、性平，有提神消化、降血压、降血脂的作用。经常食用双孢菇，能增强机体抵抗力，调节人体代谢机能，防止恶性贫血，改善神经功能，还能预防肿瘤、高血压、冠心病、肝炎和白细胞减少等多种疾病。我国是双孢菇生产大国，在世界上双孢菇产量以美国最多，我国居第二位。双孢菇产业的蓬勃发展离不开优质的双孢菇菌种，菌种作为生产的源头，其质量好坏直接关系到产品的产量和品质，因此菌种保藏也是双孢菇生产的重要环节。食用菌生产所用的菌种可以分为固体菌种和液体菌种，其中固体菌种是目前包括双孢菇在内的食用菌栽培普遍采用的菌种。固体菌种的生产需要经过母种、原种、栽培种三次转接，存在着生产成本高，生产周期长，生产效率低，菌种退化严重等缺点。相比较而言，液体菌种具有培养时间短、发菌快、生物转化率高、菌种纯度高等优势，且更便于规模化、连续生产，是食用菌大规模生产的发展趋势。然而，液体菌种不耐储藏且不便运输，有时会出现“去双核化”现象，给液体菌种的推广带来一定障碍。食用菌的菌种保藏方法有很多，通常是通过控制温度、水分、氧气、营养因素（培养基组成），降低或者抑制食用菌的生长代谢以达到菌种保藏的目的。按照环境调控可将菌种保藏方法分为：控制含水量的有冷冻干燥保藏法、控制氧气的有矿油保藏法、无菌蒸馏水和盐水保藏法，控制温度最为常用的是继代培养低温保藏法和超低温（液氮）保藏法。从现有的研究成果和实践应用来看，短期菌种保藏使用最为广泛的是继代培养低温保藏法，即在继代培养后室温存放1~2个月或者冰箱（2~8℃）存放3~4个月，此类方法需要频繁的转接，因此菌种易被污染和产生退化，而且该方法不适用于液体菌种的保藏。长期菌种保藏一般采用超低温（液氮）保藏法，这种方法保存时间可长达8年，但缺点是需要专门的设备且维护费用较高，并且操作比较复杂，要注意程序降温的方法，因此在实际生产中的应用还不太广泛。近年来，细胞固定化技术发展迅速，特别是在发酵工业上，如氨基酸、有机酸、抗生素等生产方面已广泛应用。细胞固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法和絮凝法，其中包埋法对细胞活性影响小，固定化细胞球强度高，应用最为广泛。目前细胞固定化技术在食用菌领域上的应用主要集中在固定化菌体细胞发酵生产代谢产物方面，而在菌种保藏上的应用尚处于起步阶段。基于固定化对菌种具有保护作用等优点，将该技术用于食用菌菌种保藏领域具有广阔的发展空间，是我们的重点研究方向。为了解决双孢菇液体菌种难以保存，保存之后活性易丧失，且不便运输的问题，本专利技术提供了一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法，该方法能够有效延长双孢菇液体菌种的保存时间，同时保持菌种的活力。
技术实现思路
本专利技术采用的技术方案如下：一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）液体菌种的制备：将双孢菇斜面母种转接到PDA培养基平板上，25℃培养至菌丝长满，然后用打孔器将平板上的菌丝块分割，取1-2块接种到液体培养基中，25℃先静置培养24h，再置于150-180rpm转速的摇床上振荡培养，当菌丝生长至对数期末期时结束培养；（2）菌丝体悬浮液的制备：对上述步骤获得的培养液进行离心，除去上清液，收集沉淀，将沉淀与无菌保存剂充分混合均匀，制备成菌丝体悬浮液；保存剂的添加量为培养液体积的10%；（3）菌丝体包埋小球的制备：称取一定量的海藻酸钠和普鲁兰多糖溶于去离子水中，配制成海藻酸钠浓度为7%，普鲁兰多糖浓度为1%的包埋载体溶液，115℃灭菌20min后当溶液温度降至30~40℃时，按一定体积比与菌丝体悬浮液混合，搅拌均匀，用无菌注射器或蠕动泵匀速滴入固化剂中，不断搅拌，使之形成包埋小球，在4℃冰箱中放置24h，然后分离出包埋小球，并用无菌用生理盐水洗涤3-4遍；（4）菌丝体包埋小球的保存：将菌丝体包埋小球分装于离心管中，再加入已灭菌的浓度为10%的甘油使包埋小球完全浸没，密封好离心管置于相应的温度下保存，其中在0~4℃可保存3年，在-30~-20℃可保存5年。所述步骤（1）中，液体培养基的成分为：蛋白胨0.4-0.8%，可溶性淀粉4-6%，蔗糖0.8-1.2%，磷酸二氢钾0.1-0.3%，硫酸镁0.05-0.1%，碳酸钙0.02-0.04%，维生素B10.02-0.04%，余量为水，pH自然。所述步骤（2）中，离心的转速为5000-6000r/min，离心的时间为10-15min。所述步骤（2）中，保存剂的成分为：大豆蛋白胨1-3%，甘露醇4-6%，γ-聚谷氨酸1.2-2.0%，丙氨酸0.25-0.35%，谷胱甘肽0.25-0.35%，丁酰肼0.01-0.02%，硫酸铵0.7-1.5%，柠檬酸0.2-0.6%，乙酰化单甘油脂肪酸酯0.6-1.0%，苦瓜提取物1-2%，去铁胺0.04-0.08%，聚乙二醇40000.07-0.13%，余量为水。所述步骤（2）中，包埋载体溶液与菌体悬浮液的体积比为1:1。所述步骤（2）中，包埋小球的直径为3-5mm。所述步骤（2）中，固化剂为浓度1-3%的CaCl2溶液。所述苦瓜提取物由以下方法制得：取苦瓜去籽，粉碎，用5-10倍量75%乙醇水溶液浸泡后回流提取数次，每次提取2-3h，过滤，得乙醇提取液和滤渣，合并乙醇提取液，静置24h，滤去沉淀，回收溶剂得粗提物；水溶粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用75%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得苦瓜提取物。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术根据双孢菇液体菌种的生理、生化特性，在人为创造的条件下尽量降低细胞的新陈代谢，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，并降低菌种的变异率，保证在保存期期内有足够的菌丝体数量。本专利技术保存剂中的大豆蛋白胨、甘露醇、γ-聚谷氨酸、丙氨酸、谷胱甘肽、乙酰化单甘油脂肪酸酯、苦瓜提取物、去铁胺、聚乙二醇4000均是低温缺氧状态下菌种细胞的良好保护剂，能够有效维持细胞内外渗透压，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）液体菌种的制备：将双孢菇斜面母种转接到PDA培养基平板上，25℃培养至菌丝长满，然后用打孔器将平板上的菌丝块分割，取1‑2块接种到液体培养基中，25℃先静置培养24h，再置于150‑180rpm转速的摇床上振荡培养，当菌丝生长至对数期末期时结束培养；（2）菌丝体悬浮液的制备：对上述步骤获得的培养液进行离心，除去上清液，收集沉淀，将沉淀与无菌保存剂充分混合均匀，制备成菌丝体悬浮液；保存剂的添加量为培养液体积的10%；（3）菌丝体包埋小球的制备：称取一定量的海藻酸钠和普鲁兰多糖溶于去离子水中，配制成海藻酸钠浓度为7%，普鲁兰多糖浓度为1%的包埋载体溶液，115℃灭菌20min后当溶液温度降至30~40℃时，按一定体积比与菌丝体悬浮液混合，搅拌均匀，用无菌注射器或蠕动泵匀速滴入固化剂中，不断搅拌，使之形成包埋小球，在4℃冰箱中放置24h，然后分离出包埋小球，并用无菌用生理盐水洗涤3‑4遍；（4）菌丝体包埋小球的保存：将菌丝体包埋小球分装于离心管中，再加入已灭菌的浓度为10%的甘油使包埋小球完全浸没，密封好离心管置于相应的温度下保存，其中在0~4℃可保存3年，在‑30~‑20℃可保存5年。...

【技术特征摘要】
1.一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）液体菌种的制备：将双孢菇斜面母种转接到PDA培养基平板上，25℃培养至菌丝长满，然后用打孔器将平板上的菌丝块分割，取1-2块接种到液体培养基中，25℃先静置培养24h，再置于150-180rpm转速的摇床上振荡培养，当菌丝生长至对数期末期时结束培养；（2）菌丝体悬浮液的制备：对上述步骤获得的培养液进行离心，除去上清液，收集沉淀，将沉淀与无菌保存剂充分混合均匀，制备成菌丝体悬浮液；保存剂的添加量为培养液体积的10%；（3）菌丝体包埋小球的制备：称取一定量的海藻酸钠和普鲁兰多糖溶于去离子水中，配制成海藻酸钠浓度为7%，普鲁兰多糖浓度为1%的包埋载体溶液，115℃灭菌20min后当溶液温度降至30~40℃时，按一定体积比与菌丝体悬浮液混合，搅拌均匀，用无菌注射器或蠕动泵匀速滴入固化剂中，不断搅拌，使之形成包埋小球，在4℃冰箱中放置24h，然后分离出包埋小球，并用无菌用生理盐水洗涤3-4遍；（4）菌丝体包埋小球的保存：将菌丝体包埋小球分装于离心管中，再加入已灭菌的浓度为10%的甘油使包埋小球完全浸没，密封好离心管置于相应的温度下保存，其中在0~4℃可保存3年，在-30~-20℃可保存5年。2.根据权利要求1所述的一种双孢菇液体菌种的固定化保存方法，其特征在于，所述步骤（1）中，液体培养基的成分为：蛋白胨0.4-0.8%，可溶性淀粉4-6%，蔗糖0.8-1.2%，磷酸二氢钾0.1-0.3%，硫酸镁0.05-0.1%，碳酸钙0.02-0.04%，维生素B10.02-0.04%，余量...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志标，
申请(专利权)人：张志标，
类型：发明
国别省市：江苏,32