本发明专利技术涉及一种适用于国内市场的定量检测犬瘟热病毒抗原检测卡的制备方法，具体步骤为：（1）犬瘟热病毒的分离、培养、纯化；（2）抗犬瘟热病毒配对单克隆抗体的制备，包括免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化、抗体制备及纯化；（3）犬瘟热病毒快速检测胶体金检测卡及其制备方法，包括样品垫处理、喷膜、C,T线确定、被测样本的处理、检测卡性能测定。本发明专利技术可以快速、灵敏、准确的定性检测国内犬瘟热病毒，克服了国内检测犬瘟热病毒胶体金检测卡开发用的配对单抗为进口原料，进口原料的单抗以某个国家分离的当前病毒制备，克服了检测过程中因地域遥远病毒变异漏检的现象。
A rapid detection card for canine distemper virus antigen and its preparation method
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测犬瘟热病毒抗原的检测卡及其制备方法
本专利技术涉及一种适用于国内市场的定性检测犬瘟热病毒抗原的检测卡及其制备方法，属于生物检测
技术介绍
犬瘟热是一种急性、传染性极强的病毒病，在幼犬中本病的死亡率较任何其他传染病为高。犬瘟热也是水貂的一种传染病，又称貂瘟，死亡率很高，引起严重的经济损失。10多年来，中国的犬貂市场越来越大，在宠物店，我们能看到琳琅满目的写着英文字母的诊断产品，可食用产品，治疗性用品，喜爱宠物的人们不计价钱的高低信赖进口的产品。即使是开发抗原诊断试纸产品的原材料--单克隆抗体，也是依赖进口，几年来芬兰HyTest，韩国金诺JBT等品牌几乎如垄断性的占据了中国大部分市场，但是由于他们开发抗体用的免疫原都是分离的他们本国本土的病毒，众所周知，在不同国家，不同区域都可以分离获得多株病毒，变异程度随区域而改变。市场客户反馈的问题大多是某些株型出现漏检现象，灵敏度逊色于进口产品。技术专利CN207601094Y公开了一种犬瘟热病毒试剂卡，包括试剂卡壳体及上下叠设于壳体内的多个试纸条；所述试纸条的靠近所述样品垫的一端固定有拉手；加样孔上层叠套设有多层可分离的膜套。通过在试剂卡壳体内部设置可容纳多个试纸条的腔体，并将试纸条层叠设置，需要使用时，使得最上端的试纸条以及膜套为未使用的即可，也可将已经使用的试纸条抽出丢弃或更换至最下端。本技术的犬瘟热病毒试剂卡只需要一张试剂卡即可对多个样本进行检测，或对同一样本进行多次检测，有效的降低了成本。然而，该技术专利中并未公开具体的单抗类型，且相关申请人也未公开使用何种单抗，其仅属于结构上的改进。专利技术专利申请CN201711054386.4公开了一种犬瘟热病毒抗体快速定量检测卡及使用方法，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，所述硝酸纤维素膜上包被犬瘟热病毒H蛋白抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有犬瘟热病毒结构蛋白H蛋白重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。该方法检测灵敏度高，检测的批内差及批间差小，有较好的重复性，性能稳定，既可检测全血样本，也可以检测血清和血浆样本，与RV（狂犬病毒）、CPV（犬细小病毒)、CPIV（犬副流感病毒）、CAV（犬腺病毒)、CCV（犬冠状病毒）等抗体没有交叉反应。可实现犬瘟热病毒抗体现场快速检测，但是该方法仅能用于检测血清中的抗体含量，不能有效区分是因为病毒感染产生的抗体还是接种疫苗后产生的抗体。专利技术专利申请201610537306.X公开了犬瘟热病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法，该试纸条包括PVC底板，依次粘贴在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫：金标结合垫包被有纯化的犬瘟热病毒单克隆抗体N18与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜上的检测线包被有纯化的犬瘟热病毒单克隆抗体C42，硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。我们通过分离中国区域内不同株病毒，选择致病强的毒株作为免疫原，肩负着沉重的社会责任感，致力于为中国市场提供自给自足的原材料，减弱进口的垄断，至此CDV病毒诊断的配对单抗在灵敏度方面、检测的迅速程度、漏检控制等方面都做出了积极贡献。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡及其制备方法，本专利技术为快速、灵敏、准确的检测犬瘟热病毒减少了时间和成本。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡，所述检测卡包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫，其特征在于，所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体，所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018146的杂交瘤细胞株分泌得到。所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡，所述第二单克隆抗体由保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:C2018147的杂交瘤细胞株分泌得到。一种分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株Cdv36D9于2018年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2018147，保藏地址为中国武汉-武汉大学。一种分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株Cdv37C7于2018年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2018146，保藏地址为中国武汉-武汉大学。所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡的制备方法，包括以下步骤：步骤一，抗体制备及纯化：采用动物体内腹水诱生法制备单克隆抗体36D9和37C7；采用SPA柱法对腹水进行纯化，即得抗犬瘟热病毒单克隆抗体36D9和37C7；步骤二，胶体金溶液的熬制；步骤三，抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体的标记：每1ml金液先加45微升1%K2CO3，然后再加入37C7单克隆抗体，按照每1mL胶体金溶液加入6μg抗犬瘟热病毒单克隆抗体37C7，室温下120rpm摇30min，加入10%牛血清白蛋白20μL，室温下120rpm摇30min，12000rpm离心20min，弃上清，用0.01MPBS溶解沉淀，即得到标记好的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物；步骤四，金标垫处理及胶体金膜的制备：选择聚脂纤维6613作为金标结合垫。将金标垫浸泡在处理液A中5min，处理液A为0.01MPBS，pH7.4，0.2%TritonX-100，取出37℃烘干，备用；将标记好的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度喷涂在处理好的金标垫上，室温自然晾干或者37℃烘干，制成含有抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物的胶体金膜；步骤五，样品垫处理：选择DL42为样品垫，将样品垫，浸泡在处理液B中5min，处理液B为0.01MPBS，pH7.4，1%TritonX-100，1%BSA，0.05%NaN3，取出37℃烘干，备用；步骤六，C、T线确定：选择SartoriusCN140膜，分别将抗犬瘟热病毒36D9单克隆抗体和羊抗鼠二抗作为T线和C线划在NC膜上，浓度分别为1mg/mL和0.6mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在NC膜上，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干，制成基膜；步骤七，检测卡的组装。所述胶体金溶液的熬制采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，具体步骤为：量取99mL的超纯水装入250mL的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加入1%氯金酸溶液1mL，适当速度搅拌，打开加热开关，待溶液沸腾后迅速一次性加入1.6mL1%柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由灰色逐渐变为酒红色，颜色稳定后继续加热10min，待溶液冷却后，用微孔滤膜过滤，4℃保存备用，紫外扫描得到最大吸收峰为523nm的胶体金颗粒。所述胶体金颗粒大小为25nm。所述胶体金标记的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体的悬浮保存液配方组成为pH8.5的0.01本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡，所述检测卡包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫，其特征在于，所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体，所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO: C2018146的杂交瘤细胞株分泌得到。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡，所述检测卡包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫，其特征在于，所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体，所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018146的杂交瘤细胞株分泌得到。2.根据权利要求1所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡，所述第二单克隆抗体由保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:C2018147的杂交瘤细胞株分泌得到。3.权利要求1或2所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡的制备方法，包括以下步骤：步骤一，抗体制备及纯化：采用动物体内腹水诱生法制备单克隆抗体36D9和37C7；采用SPA柱法对腹水进行纯化，即得抗犬瘟热病毒单克隆抗体36D9和37C7；步骤二，胶体金溶液的熬制；步骤三，抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体的标记：每1ml金液先加45微升1%K2CO3，然后再加入37C7单克隆抗体，按照每1mL胶体金溶液加入6μg抗犬瘟热病毒单克隆抗体37C7，室温下120rpm摇30min，加入10%牛血清白蛋白20μL，室温下120rpm摇30min，12000rpm离心20min，弃上清，用0.01MPBS溶解沉淀，即得到标记好的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物；步骤四，金标垫处理及胶体金膜的制备：选择聚脂纤维6613作为金标结合垫；将金标垫浸泡在处理液A中5min，处理液A为0.01MPBS，pH7.4，0.2%TritonX-100，取出37℃烘干，备用；将标记好的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度喷涂在处理好的金标垫上，室温自然晾干或者37℃烘干，制成含有抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物的胶体金膜；步骤五，样品垫处理：选择DL42为样品垫，将样品垫，浸泡在处理液B中5min，处理液B为0.01MPBS，pH7.4，1%TritonX-100，1%BSA，0.05%NaN3，取出37℃烘干，备用；步骤六，C、T线确定：选择SartoriusCN140膜，分别将抗犬瘟热病毒36D9单克隆抗体和羊抗鼠二抗作为T线和C线划在NC膜上，浓度分别为1mg/mL和0.6mg/mL...
【专利技术属性】
技术研发人员：武玉香，于金枝，孙珊珊，唐世云，刘捷，
申请(专利权)人：山东绿都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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