一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条制造技术

本发明专利技术公开一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，胶体金结合垫上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A‑胶体金标记物，硝酸纤维素膜上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体B的检测线和山羊抗鼠IgG的质控线，单克隆抗体A由编号为10F10的杂交瘤细胞分泌产生，单克隆抗体B由编号为4A11的杂交瘤细胞分泌产生。本发明专利技术的试纸条使用双单抗检测，检测快速、灵敏度高且特异性强，检测结果清晰易于判断，整个检测过程无需任何仪器、操作人员无需任何专业培训；试纸条的使用操作简单，适于现场诊断使用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条
本专利技术属于动物疫病检测
，具体涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征，病理变化主要表现在猪的空肠和回肠部分的肠绒毛萎缩和脱落。PED最初爆发于英国，随后在包括我国在内的世界多个地区爆发流行。我国自2010年下半年以来，中国华南、华东和华北部分省份出现了严重的仔猪腹泻流行，造成大量哺乳仔猪的死亡，PED对世界养猪业造成了持续的影响，并导致严重的经济损失。鉴于PED的严重危害，建立一种灵敏快速高效的PEDV诊断方法十分必要。目前检测猪流行性腹泻病毒的方法有免疫电镜法、免疫荧光法、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验和RT-PCR法。免疫电镜法具有简便、直观、快速和定性正确等优点，由于需要电镜设备，不适合于大规模诊断和临床诊断。免疫荧光法该方法具有较高的准确性和特异性，但是操作繁琐，需要特殊的仪器设备。微量血清中和试验操作繁琐，试验操作中的一些人为因素对结果影响较大。酶联免疫吸附试验操作相对简单，但也需要仪器设备。其中RT-PCR法尽管此法敏感性和特异性都很好，但由于需要特殊的仪器设备，目前只适合于实验室诊断，不适合于临床诊断。胶体金免疫层析分析(Gold-immunochromatographyassay，GICA)是近年发展起来的一种以胶体金为标记物，通过抗原抗体免疫学反应对样本中的生物大分子进行定性分析的免疫学分析技术。该技术操作简单快速，不需要任何仪器，操作人员也不需专业的技术培训，可以满足临床诊断的需求。中国专利申请号201310317343.6，一种用于检测猪流行性腹泻病毒的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用，此专利技术的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的抗PEDV单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，所述的硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线以及兔抗PEDVS蛋白多克隆抗体包被的检测线。该专利技术中的检测线使用的是兔抗PEDVS蛋白多克隆抗体，其非特异性强，测试灵敏性相对较弱。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，适于现场诊断使用，试纸条的使用操作简单、检测快速、灵敏度高且特异性强，检测结果清晰易于判断，整个检测过程无需任何仪器、操作人员无需任何专业培训。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、胶体金结合垫和吸水纸，所述硝酸纤维素膜粘贴在所述聚氯乙烯底板上，所述硝酸纤维素膜的两端分别粘贴有所述胶体金结合垫、吸水纸，所述胶体金结合垫上粘贴有所述样品垫；所述胶体金结合垫上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A-胶体金标记物，与所述胶体金结合垫相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体B的检测线，与所述吸水纸相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有山羊抗鼠IgG的质控线；所述单克隆抗体A由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为10F10的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞10F10，地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2019年1月14日，保藏编号为CCTCCNO:C201905；所述单克隆抗体B由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为4A11的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞4A11，地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2019年1月14日，保藏编号为CCTCCNO:C201904。胶体金颗粒与所述单克隆抗体A因静电吸附而形成牢固结合；当含有猪流行性腹泻病毒的待测样本加到样品垫上后，通过毛细作用向前移动，猪流行性腹泻病毒与单克隆抗体A形成特异性结合，从而将猪流行性腹泻病毒与单克隆抗体A-胶体金标记物结合在一起，使得猪流行性腹泻病毒上带上标记；继续向前移动至检测线后，被标记的猪流行性腹泻病毒聚集在检测线上而显色，使用者肉眼即可识别检测结果。本专利技术采用编号为10F10的杂交瘤细胞、编号为4A11的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体A、单克隆抗体B，特异性强、敏感性高、同质性高，使用本专利技术制备的试纸条，检测结果的一致性、准确性、重复性高。优选地，所述单克隆抗体A-胶体金标记物的具体制备步骤为：在胶体金中加入碳酸钾调节pH至8.0后，边磁力搅拌边滴加所述单克隆抗体A，搅拌40min后再加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为1％，继续搅拌40min后分装于离心管中，10000r/min离心30min，弃去上清液；将离心分离出的沉淀加入0.01mol/L、pH值为9.0的Tris缓冲液中重悬，即得到抗猪流行性腹泻病毒的所述单克隆抗体A-胶体金标记物。优选地，编号为10F10的杂交瘤细胞、编号为4A11的杂交瘤细胞由纯化的猪流行性腹泻病毒筛选得到；猪流行性腹泻病毒的纯化具体包括以下步骤：S301.将猪流行性腹泻病毒液反复冻融3次，在2～8℃条件下，12000r/min离心10分钟，收集猪流行性腹泻病毒上清液；S302.在体积为V的所述猪流行性腹泻病毒上清液中一边加入硫酸铵一边持续搅拌，搅拌完成后2～8℃沉淀过夜；每100mL猪流行性腹泻病毒上清液中加入42.5g硫酸铵；S303.将步骤S302中沉淀过夜后的猪流行性腹泻病毒上清液12000r/min离心10分钟，弃去上清并将离心分离出的沉淀用体积为3％V、浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS重悬；S304.将步骤S303中得到的重悬病毒混合液在0.85％的氯化钠溶液中、2～8℃下透析，中途换液3次；透析之后在2～8℃条件下，以27000r/min离心2小时并弃去上清，沉淀用体积为3％V、浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS重悬；S305.制备质量浓度为20％、35％、45％和60％的不连续梯度的蔗糖溶液，将步骤S304中得到的重悬病毒混合液加在20％蔗糖界面上；在2～8℃条件下，以35000r/min离心90分钟，收集20％层～35％层界面之间的病毒液，－20℃保存备用。采用不连续梯度分布的蔗糖溶液实现猪流行性腹泻病毒的纯化，保证后续单克隆抗体A、单克隆抗体B制备的纯度，从而提高胶体金试纸条的检测准确性。优选地，所述单克隆抗体A-胶体金标记物按10μL/cm的速度喷于所述胶体金结合垫上。优选地，所述检测线的制备方法为：将包含浓度为0.5mg/mL的所述单克隆抗体B按0.8μL/cm的速度喷于所述硝酸纤维素膜上。优选地，所述质控线的制备方法为：将包含浓度为1.5mg/mL的羊抗鼠IgG按0.8μL/cm的速度喷于所述硝酸纤维素膜上。优选地，所述检测线与质控线之间的距离为5mm。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1)特异性强，采用抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体制备单克隆抗体A-胶体金标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、胶体金结合垫和吸水纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜粘贴在所述聚氯乙烯底板上，所述硝酸纤维素膜的两端分别粘贴有所述胶体金结合垫、吸水纸，所述胶体金结合垫上粘贴有所述样品垫；所述胶体金结合垫上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A‑胶体金标记物，与所述胶体金结合垫相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体B的检测线，与所述吸水纸相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有山羊抗鼠IgG的质控线；所述单克隆抗体A由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为10F10的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞10F10，保藏编号为CCTCC NO:C201905；所述单克隆抗体B由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为4A11的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞4A11，保藏编号为CCTCC NO:C201904。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、胶体金结合垫和吸水纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜粘贴在所述聚氯乙烯底板上，所述硝酸纤维素膜的两端分别粘贴有所述胶体金结合垫、吸水纸，所述胶体金结合垫上粘贴有所述样品垫；所述胶体金结合垫上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A-胶体金标记物，与所述胶体金结合垫相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体B的检测线，与所述吸水纸相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有山羊抗鼠IgG的质控线；所述单克隆抗体A由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为10F10的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞10F10，保藏编号为CCTCCNO:C201905；所述单克隆抗体B由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为4A11的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞4A11，保藏编号为CCTCCNO:C201904。2.根据权利要求1所述的一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述单克隆抗体A-胶体金标记物的具体制备步骤为：在胶体金中加入碳酸钾调节pH至8.0后，边磁力搅拌边滴加所述单克隆抗体A，搅拌40min后再加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为1％，继续搅拌40min后分装于离心管中，10000r/min离心30min，弃去上清液；将离心分离出的沉淀加入0.01mol/L、pH值为9.0的Tris缓冲液中重悬，即得到抗猪流行性腹泻病毒的所述单克隆抗体A-胶体金标记物。3.根据权利要求1所述的一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，其特征在于，编号为10F10的杂交瘤细胞、编号为4A11的杂交瘤细胞由纯化的猪流行性腹泻病毒筛选得到；猪流行性腹泻病毒的纯化具体包括以下步骤：S301.将猪流行性腹泻...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾慧勤，孙圣福，但汉并，董晓辉，李盼盼，张弛，马磊，范俊青，周云朵，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42