用于识别微生物的质谱方法和试剂盒技术

本发明专利技术包含一种用于识别样品中的微生物的新颖方法和系统，所述样品包含可能干扰对所述微生物的识别的来自非微生物来源的蛋白质和其它生物材料(例如，来源于哺乳动物的蛋白质)。本文所述的方法和系统包含在质谱分析之前使用一次性色谱介质来纯化完整蛋白质。本文所述的色谱介质和方法可以快速且高效地从粗细胞裂解物中去除大部分干扰生物材料(例如，哺乳动物蛋白)，同时保持高信号强度并去除足够的一种或多种干扰蛋白以允许通过质谱分析来识别一种或多种微生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于识别微生物的质谱方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请要求于2017年8月25日提交的题为“用于识别干扰基质中的混合微生物的设备和方法(APPARATUSANDMETHODSFORIDENTIFICATIONOFAMIXMICROORGANISMINANINTERFERINGMATRIX)”的芬兰申请号20165634的优先权和权益，所述芬兰申请整体并入本文。
技术介绍
近年来，与用于识别微生物的传统方法相比，作为用于识别微生物的工具，质谱已经由于其准确性增加和结果时间(time-to-result)缩短而受到欢迎。迄今为止，用于微生物识别的最常见的质谱是基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱。在MALDI-TOF中，将未知微生物的细胞与合适的紫外光吸收基质溶液混合，并使其在样品板上干燥。替代性地，使用微生物细胞的提取物，而不是完整细胞。在转移到质谱仪的离子源之后，将激光束引导到样品以对蛋白质进行解吸和电离，并且收集时间相关的质谱数据。通过MALDI-TOF方法产生的微生物质谱图揭示了构成微生物的“特征(fingerprint)”的完整肽、蛋白质和蛋白质片段的许多峰。这种方法依赖于未知微生物的质谱图中的峰曲线与包括使用基本相同的实验条件获得的已知微生物的光谱集合的参考数据库的模式匹配。分离的微生物的光谱与参考数据库中的光谱之间的匹配越好，在属、种或在一些情况下亚种层次下的生物体识别的置信水平越高。因为所述方法依赖于匹配MALDI-TOF质谱图中的峰的模式，所以不需要识别或以其它方式表征未知微生物的光谱中表示的蛋白质以将其识别。已经使用了用于检测微生物的若干其它质谱方法——这些方法包含所谓的“自下而上(bottom-up)”和“自上而下(top-down)”方法。在自下而上方法中，蛋白质提取物可以用一种或多种蛋白酶消化，然后通过耦合到质谱的液相色谱对肽进行的一个或多个维度的分离。通过将蛋白水解肽或其串联质谱图的质量与从数据库预测的那些进行比较，可以识别肽并将多个肽识别组合成蛋白质识别。在自上而下方法中，可以识别微生物，并且在一些情况下，通过分析在分离和质谱之前未经酶消化的完整蛋白质来定量微生物。从微生物中提取的完整蛋白质优选地通过一个或多个维度的液相色谱分离(但是在一些方法中，蛋白质提取物可以直接注入到质谱仪中)，然后注入到质谱仪中。可以在第一质谱步骤(MS)中通过确定提取物中足够数量的蛋白质的完整质量来识别生物体。在第二质谱步骤(MS/MS)中，来自第一质谱步骤的所选蛋白质可以在质谱仪中片段化——蛋白质的片段化模式可以用于增强第一步骤中的识别的确定性。自上而下方法的主要优点包含能够检测降解产物、序列变体和翻译后修饰的组合。质谱的使用已经彻底改变了临床微生物学并且缩短了诊断时间且提高了诊断的准确性。然而，质谱分析，特别是MALDI-TOF，尚未被广泛用于一些临床样品，因为这些样品包含可能影响分析的可靠性和准确性的复杂基质(例如，源自哺乳动物的蛋白质)。例如，血液培养物代表微生物学实验室的最紧迫且最关键的样品。虽然关键的患者护理将最大程度地得益于使用质谱成功分析血液培养物(由于显著更快的结果时间)，但目前尚未广泛使用此应用，因为血液培养物样品仍然是质谱中最具挑战性的样品类型。事实上，MALDI-TOF通常仅为阳性血液培养物提供非常低的灵敏度和特异性(约70％到80％)。具有类似复杂基质的其它样品(例如，尿液和脑脊髓液)也提供低灵敏度和特异性。由于MALDI分析对具有复杂基质的样品的灵敏度非常低，因此存在产生真实阳性样品的假阴性的显著危险，并且可能甚至更糟糕的是，阴性样品的假阳性。
技术实现思路
本专利技术包含一种用于识别样品中的微生物的新颖方法和系统，所述样品包含可能干扰对所述微生物的识别的来自非微生物来源的蛋白质和其它生物材料(例如，来源于哺乳动物的蛋白质)。从来自疑似患有微生物感染的患者的流体、组织和培养物中识别微生物是临床微生物学中最关键的测定之一并且对于患者护理来说至关重要。可以使用完整蛋白质作为分析物通过质谱(MS)识别微生物，如已经使用MALDI-TOF或电喷雾电离(ESI)表明的。然而，除了一种或多种目标微生物之外，许多临床样品还包含非常复杂且具有挑战性的基质(例如，哺乳动物细胞、蛋白质、体液、介质组分等)。在这种样品中，可以提取来自通过质谱识别所需的微生物的蛋白质，但是它们的信号可以被基质中的蛋白质(例如，哺乳动物来源的蛋白质)抑制或淹没。特别具有挑战性的基质的一个实例是血液。在疑似患有败血症的患者中，快速识别致病微生物可以字面上意味着生与死之间的差异。然而，当裂解红细胞时，血红蛋白以高浓度结合到细菌细胞，并且血红蛋白可以进入微生物裂解物中并且可以压倒来自一种或多种微生物的蛋白质的信号。挑战在于快速并有效地去除足够的血红蛋白以使微生物蛋白的信号可见，而不会去除如此多的蛋白质以至于整体信号强度太低。如但不限于尿液和脑脊髓液的流体呈现类似的基质挑战。本文所述的方法和系统包含在质谱分析之前使用一次性色谱介质来纯化完整蛋白质。来自微生物提取物的蛋白质与色谱介质结合，在那里将它们洗涤，并且然后洗脱用于质谱分析。令人惊讶和出乎意料的是，已经发现本文所述的所述色谱介质和所述方法可以快速并有效地从粗细胞裂解物去除大部分干扰生物材料(例如哺乳动物蛋白)，同时保持高信号强度并去除足够的一种或多种干扰蛋白以允许通过质谱分析识别一种或多种微生物。本文描述的过程可以非常快。同样，本专利技术的方法简单且快速，因为不需要对样品进行化学或酶消化，并且实时完成数据处理。来自培养物或(假设足够高的微生物负载)体液或表面拭子的样品制备可以在短到约15分钟(例如，15分钟到30分钟)内进行。质谱分析可以在几分钟内完成，例如，小于10分钟，小于5分钟或在约一分钟或更短时间内。初始质谱通常足以将一种或多种微生物识别为属或种水平。可以要求额外的质谱分析(例如，靶向的MS和MSn)以进一步表征在第一质谱步骤中识别的微生物，以例如识别菌株、亚种、病原体或血清型水平的一种或多种微生物，或者根据需要确定毒力因子、抗生素抗性标记、抗生素敏感性标记或其它特性。此第二阶段可以在几分钟内进行，例如，少于15分钟，少于10分钟或在约五分钟或更短时间内。两个阶段都依赖于检测和识别来自微生物的完整蛋白质，而不将那些蛋白质的化学、物理或酶促降解为其取代肽。方法适用于各种不同的样品类型，包含来自临床样品的纯培养物或混合培养物样品，包含但不限于血液、脓液、尿液、泪液、鼻涕、淋巴液、滑液、脑脊髓液、粪便、痰、伤口和身体部位拭子、以及来自其它来源的样品，包含工业或环境样品，如食物(例如肉类和乳制品样品、水果和蔬菜)、饮料、土壤、水(例如城市废水)、空气和表面拭子。并且虽然以下讨论集中于通过蛋白质的表征来识别微生物，但是本文讨论的方法和系统同样适用于通过表征小分子、脂质或碳水化合物等中的一种或多种来识别微生物等。在急性感染中，病原体通常大量存在。例如，在泌尿道或肾脏发炎的情况下，在一毫升尿液中存在约105到107个病原体。由于质谱分析仅需要约103到104个微生物，离心将立即产生足够量的病原体用于质谱识别。如果离心样品中存在超过105种微生物病原体，则肉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于识别流体中的微生物的方法，所述流体包括来自哺乳动物来源的干扰蛋白，所述方法包括：制备裂解物，所述裂解物包括所述干扰蛋白和来自所述微生物的蛋白质；使所述裂解物与色谱介质接触，其中所述干扰蛋白和来自所述微生物的所述蛋白质结合到所述色谱介质；选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质以产生至少一种经过洗脱的级分，其中来自所述微生物的所述蛋白质中富集了所述至少一种经过洗脱的级分并且所述干扰蛋白中缺少所述至少一种经过洗脱的级分；以及使所述至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析以识别所述流体中一种或多种微生物的存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.25 FI 201656341.一种用于识别流体中的微生物的方法，所述流体包括来自哺乳动物来源的干扰蛋白，所述方法包括：制备裂解物，所述裂解物包括所述干扰蛋白和来自所述微生物的蛋白质；使所述裂解物与色谱介质接触，其中所述干扰蛋白和来自所述微生物的所述蛋白质结合到所述色谱介质；选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质以产生至少一种经过洗脱的级分，其中来自所述微生物的所述蛋白质中富集了所述至少一种经过洗脱的级分并且所述干扰蛋白中缺少所述至少一种经过洗脱的级分；以及使所述至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析以识别所述流体中一种或多种微生物的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体是血液、血液培养物、尿液或脑脊髓液之一。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述干扰蛋白包含血红蛋白、防御素或其蛋白水解产物中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的方法，其中制备所述裂解物包含：裂解所述微生物的细胞以释放其内容物。5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括：将细胞片段和未裂解的微生物细胞与所述微生物细胞的所述内容物分离以产生所述裂解物。6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括：提供所述流体；使所述流体与被选择用于裂解所述流体中的哺乳动物细胞而不是所述微生物的细胞的裂解剂接触；将所述微生物的所述细胞与经过裂解的哺乳动物细胞分离；洗涤所述微生物的所述细胞。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述裂解物与色谱介质接触包含：提供其中具有所选量的所述色谱介质的容器；将所述裂解物加入所述容器并且使所述裂解物与所述色谱介质混合；通过离心集结所述色谱介质以将所述色谱介质与所述裂解物分离；在洗涤缓冲液介质中洗涤所述色谱介质；以及集结所述色谱介质以将所述色谱介质与所述洗涤缓冲液分离；并且其中选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质是用洗脱缓冲液执行的。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述裂解物与色谱介质接触包含：提供含有由所述色谱介质构成的层的提取盒；将所述裂解物加入所述提取盒并且使所述裂解物流过所述色谱介质层；以及将洗涤缓冲液加入所述提取盒并且使所述洗涤缓冲液流过所述色谱介质层；并且其中选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质是用洗脱缓冲液执行的。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述提取盒在液相色谱系统中是内联的，并且所述裂解物是通过泵加入所述提取盒的。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括水和范围为10vol％到60vol％的乙腈。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中蛋白质质谱分析是MALDI或ESI-MS之一。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质选自由以下组成的组：反相介质、正相介质、离子交换介质、亲和色谱介质、尺寸排阻介质、疏水相互作用介质和其组合。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质由以下制备：选自由以下组成的组的单体：含经取代或未经取代的乙烯基的单体、含经取代或未经取代的丙烯酸酯的单体、含经取代或未经取代的甲基丙烯酸酯的单体、丙烯酰胺、经氟取代的乙烯；选自由以下组成的组的聚合物：聚烯烃、聚酯、聚氨酯、聚酰胺；和其组合。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述单体包含至少两种单体的混合物，所述单体以10vol.％到70vol.％的量存在。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质由以下中的任何两种或更多种的混合物制备：二乙烯基苯、苯乙烯和乙基乙烯基苯。16.一种用于识别流体中的微生物的方法，所述流体包括干扰哺乳动物蛋白和来自所述微生物的蛋白质，所述方法包括：制备裂解物，所述裂解物包含所述流体中的所述干扰哺乳动物蛋白和来自所述微生物的所述蛋白质，其中所述流体选自由以下组成的组：全血、血液培养物、尿液和脑脊髓液，其中制...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·科斯吉奈恩，L·瓦尔姆，J·兰尼斯托，K·弗鲁克，R·格里斯特，A·兰塔卡利，
申请(专利权)人：赛默飞世尔科学有限公司，
类型：发明
国别省市：芬兰,FI