一种检测甲基睾酮残留的胶体金试纸条制造技术

本发明专利技术提供了一种检测甲基睾酮残留的胶体金试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和背衬，所述反应膜上具有包被甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫包被甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物。本发明专利技术还提供了一种应用上述试纸条检测甲基睾酮的方法，它包括步骤：首先进行样品前处理，然后用试纸条进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的试纸条可用于检测动物组织样品如猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉中的甲基睾酮残留量，其操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低，能够现场监控，满足大量样品筛查的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽药残留的免疫化学速测
，更具体地涉及一种检测甲基睾酮残留的胶体金试纸条，借助胶体金标记显色的免疫层析反应，快速检测甲基睾酮残留。技术背景甲基睾酮(17α-Mehthyltestosterone，MT)是一种人工合成的固醇类药物，又叫做甲基睾丸酮、甲基睾丸素和甲睾酮，属于蛋白同化激素。在水产养殖中，它作为一种性激素既能促进器官成熟与第二特征的发育，又有促进蛋白质合成的同化作用，使肌肉增长、体重增加，被作为水产品养殖过程中的一种性激素和强壮剂添加到饲料中。由于甲基睾酮代谢时间长，通过食物链被人体摄入，扰乱人体激素平衡，导致孕妇有女胎男性化和新生儿畸形，影响儿童的正常生长发育，且具有致癌、致畸、致突变的作用。欧盟95/22/EC中规定在养殖中禁止使用甲基睾酮等性激素类兽药，我国也在2003年发布的公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定甲基睾酮为禁止使用兽药，在动物源性组织中不得检出。目前检测食品中甲基睾酮的残留量主要采用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用法(GC-MS)、液质联用法(LC-MS)等。仪器分析方法虽然灵敏、准确、分离度高，并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求，不适于大规模样本筛查。胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，该方法将反应所需要的原料全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟至数十分钟，检测结果以肉眼可见的显色条带来判读。此法具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有的检测甲基睾酮的方法存在的对设备依赖性高、不能够实现对大批量样品的快速检测的缺点，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的试纸条，以实现对大批量的甲基睾酮样品进行快速检测和现场监控。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了一种检测甲基睾酮残留的胶体金试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和背衬，所述反应膜上具有包被甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫包被甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物。本专利技术将甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物固化于反应膜检测线内，并用胶体金标记甲基睾酮单克隆抗体，通过待测样品中的甲基睾酮和包被在反应膜上的甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物共同竞争甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线颜色深浅或有无红色条带来判断样品液中是否含有甲基睾酮残留。检测时，样品滴入试纸卡孔内，当甲基睾酮在样品中浓度低于1.0mg/kg时，胶体金抗体在层析过程中会被固定在反应膜上的甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)处各出现一条红色条带，且T线显色比C线显色深或与C线显色一致。如果甲基睾酮在样品中浓度高于1.0mg/kg时，胶体金抗体与样品中的甲基睾酮全部结合，从而在T线内因为竞争反应不与甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比C线显色浅。如图2所示。阴性：当(C)线显示出红色条带，(T)线同时显示出红色条带，且(T)线颜色接近或深于(C)线时，判为阴性，表示甲基睾酮含量小于1.0mg/kg，用“-”表示。阳性：当(C)线显示出红色条带，而(T)线不显色或(T)线颜色浅于(C)线时，判为阳性，表示甲基睾酮含量超过1.0mg/kg，用“+”表示。无效：当(C)线不显示出红色条带，则无论(T)线显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。本专利技术还提供了制备上述试纸条的方法，其包括步骤：1)制备包被甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2)制备具有包被甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和背衬组装成试纸条。具体地说，其步骤包括：1)将甲基睾酮与氨基丙酸反应，制备甲基睾酮半抗原；2)将甲基睾酮半抗原与载体蛋白偶联，制备甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物；3)用甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌甲基睾酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株；4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5)将甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，并将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线，用含0.5％脱脂奶粉的封闭液进行封闭；6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；7)将制备的甲基睾酮单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物；8)将结合物释放垫用含0.1％～0.5％酪蛋白的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾混合缓冲液浸泡30s，37℃烘2h，然后将甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上；9)将样品吸收垫用含0.1％～0.5％牛血清白蛋白、0.5％～1％吐温-80的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾混合缓冲液浸泡2h，37℃烘2h；10)在背衬上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装。结合物释放垫的1/3被样品吸收垫覆盖可以延长检测结果观察时间，可使样品吸收垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而减少误差。本专利技术的试纸条具有灵敏度高、操作简单、检测时间短、储存简单、保质期长成本低等优点，能够现场监控，适合大量样本筛查。附图说明图1为试纸条剖面结构示意图，图中：1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、背衬；图2为试纸条检测结果判定图；图3为甲基睾酮半抗原合成图；图4为甲基睾酮半抗原核磁共振氢谱图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本专利技术进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入专利技术的保护范围。实施例1检测甲基睾酮残留的胶体金试纸条的制备该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1)制备包被甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2)制备具有包被甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和背衬组装成试纸条。下面分步详细叙述：1、甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定(1)甲基睾酮半抗原的制备取0.5g甲基睾酮加20mL乙醇溶解，加0.27g碳酸钾，搅拌；取0.33g氨基丙酸加3mL蒸馏水溶解，加入到甲基睾酮的乙醇溶液中，60℃反应4h。停止反应，检测，原料基本无剩余。旋蒸蒸干，加水，调节pH值到6，加乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥蒸干，得到浅黄色油状物，加二氯甲烷/石油醚(1∶3)重结晶，即得到半抗原产物，合成路线见图3。取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，结果见图4。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：11.0(s，1H，COOH)，5.62(s，1H，-CH＝)，3.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测甲基睾酮残留的胶体金试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和背衬，其特征在于所述反应膜上具有包被甲基睾酮半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫包被甲基睾酮单克隆抗体‑胶体金标记物；其中，所述甲基睾酮半抗原‑载体蛋白偶联物由甲基睾酮和氨基丙酸反应得氨基丙酸化甲基睾酮，然后与载体蛋白偶联得到。

【技术特征摘要】
1.一种检测甲基睾酮残留的胶体金试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和背衬，其特征在于所述反应膜上具有包被甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫包被甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物；其中，所述甲基睾酮半抗原-载体蛋白偶联物由甲基睾酮和氨基丙酸反应得氨基丙酸化甲基睾酮，然后与载体蛋白偶联得到。2.如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于所述甲基睾酮单克隆抗体-胶体金标记物中的甲基睾酮单克隆抗体是以氨基丙酸化甲基睾酮与载体蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宏鑫，
申请(专利权)人：北京安达兴业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11