一种核酸抗体修饰的免疫金探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种核酸抗体修饰的免疫金探针及其制备方法和应用。该方法综合使用了点击化学技术和寡核苷酸标记纳米金颗粒技术等一系列工艺，对抗体与DNA的偶联条件，标记寡核苷酸的纳米金颗粒的制备条件进行优化，最大限度地提高标记在纳米金颗粒上的寡核苷酸的稳定性和密度以及结合在纳米金颗粒上的抗体数量，以该方法制备的新型金纳米探针可以用于具有细胞靶向性的特异性检测，病毒的可视化检测，制备超灵敏的检测试纸条，相较于现有技术，以本发明专利技术制备的产品具有特异性高，稳定性好，应用领域广泛等特点，加之工艺简便，成本较低，因此有很好的推广前景。

An Immunogold Probe Modified by Nucleic Acid Antibody and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种核酸抗体修饰的免疫金探针及其制备方法和应用
本专利技术属于免疫金探针制备
，具体涉及一种核酸抗体修饰的免疫金探针及其制备方法和应用。
技术介绍
早在很久以前，人们就对金溶胶开始研究，18世纪后，Faraday利用科学的方式对其进行研究，从此之后，人们对金溶胶的合成的研究方向开始转移到对其合成的方式和其应用方向等，随着纳米技术的不断发展，纳米材料和纳米结构获得了引人瞩目的成就，为生物医学的发展提供了新的契机。1996年，Mirkin团队发现了一种能将多价核酸与纳米金颗粒结合的方式，核酸与球形金颗粒表面共价连接，形成具有高密度富集和高度定向核酸的功能化纳米结构，这是第一个具有优良性质的球形核酸结构，由金芯和核酸外壳构成。该结构表现出纳米金颗粒和核酸两种物质的性能，因此，球形核酸相对于一些其他病毒载体和许多其他合成系统具有一定优势，包括低毒性、低免疫原性、抗酶降解、更稳定的基因敲除等等。这种结构能够在外壳核酸周围制造高盐浓度区，保护核酸不会被酶分解，并且能在细胞外环境中在表面富集清除蛋白，从而促进细胞内吞。这种球形核酸的功能，适用于各种类型的细胞，包括原代细胞，所以在后期研究中发现其不能区分健康细胞与癌细胞，无法特异性治疗，进而研究具有特异性的球形核酸，仍然是一个具有重要意义的课题。近年来，点击化学以其应用范围广，反应条件简单，速度快，产率高，环境友好，选择性强等诸多优点收到现在许多科学家的青睐，它是由化学家Sharpless在2001年引入的一个有机合成概念，通过小单元的拼接，尤其强调在温和的反应条件下高选择性的形成碳——杂原子键，快速可靠地完成形形色色的分子合成，在绿色合成和原子经济时代的背景下，点击化学的提出为构建功能性分子系统开拓出一条高通量，高产率，高选择性的合成路线。点击化学的典型代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应，通过该反应可以将Fc端修饰有叠氮的抗体与核酸相结合，进而将抗体结合到球形核酸上形成新型抗体结合的金纳米探针，传统的金纳米探针是通过静电吸附和表面修饰的A蛋白去结合抗体，但缺点在于探针不够稳定，极其容易聚团，这对一些病原检测和试纸条的制备造成很大的弊端，用本专利技术提及的核酸抗体修饰的办法可以有效提高探针的稳定性以及特异性，为今后金探针研究提供了新的思路拓宽了应用领域。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种核酸抗体修饰的免疫金探针。本专利技术旨在利用点击化学和球形核酸制备技术，制备一种核酸抗体修饰的新型金纳米探针，以解决现有金探针结构不稳定，易聚团，特异性较差的问题。本专利技术还要解决的技术问题是提供了核酸抗体修饰的免疫金探针的制备方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供了该核酸抗体修饰的免疫金探针的应用。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：所述的免疫金探针包括纳米金颗粒核心和表面修饰的核酸抗体结合物，所述核酸抗体结合物中的核酸为炔基修饰的长链DNA，所述长链DNA的核苷酸序列为：TTTATATAGAGGAGTTTTTTTTTT。其中，所述纳米金颗粒核心为结合了巯基修饰的反义长链DNA和短链DNA的纳米金颗粒，所述反义长链DNA的核苷酸序列为CTCCTCTATATAAATTTTTTTTTTTT，所述短链DNA的核苷酸序列为TTTTTTTTTT。其中，所述纳米金颗粒的粒径为15nm。本专利技术所使用的核酸分为两种，一种长链DNA，用于结合抗体，一种为短链DNA，用于降低长链DNA的分布密度，减少表面抗体的修饰量，防止探针粘连，提高探针的分散性。本
技术实现思路
还包括所述的核酸抗体修饰的免疫金探针的制备方法，包括以下步骤：1)将抗体和叠氮化合物按一定比例混合，在室温环境下，摇晃结合一定时间得到样品；2)将步骤1)结合后的样品吸出，加入透析袋放置于PBS中透析过夜得到抗体叠氮结合物；3)将透析过夜的抗体叠氮结合物取出，加入炔基修饰的长链DNA和催化剂，室温下摇晃结合得到核酸抗体结合物；4)将结合好的核酸抗体结合物再次加入透析袋，放置于PBS中，透析过夜，中间换一次透析液，获得背景较为干净的核酸抗体结合物；5)将纳米金颗粒与巯基修饰的反义长链DNA和短链DNA按一定浓度比例混合，在室温下结合；6)在巯基修饰的反义长链DNA和短链DNA与纳米金颗粒结合一段时间后，每隔一段时间滴加一定量一定浓度的NaCl溶液获得纳米金颗粒核心；7)将步骤4)得到的核酸抗体结合物与纳米金颗粒核心在金属浴中结合；8)将步骤7)结合后的样品离心，重悬，获得浓缩后的核酸抗体修饰的免疫金探针。其中，所述步骤1)的抗体和叠氮化合物摩尔比为1:30，结合时间为4小时。其中，所述步骤3)中的催化剂为硫酸铜，异抗坏血酸钠，THPTA和盐酸氨基胍混合溶液。其中，所述硫酸铜浓度为0.5mM，异抗坏血酸钠终浓度为0.05mM，THPTA终浓度为0.002mM、氨基胍盐酸盐终浓度为0.05mM。其中，所述步骤5)的纳米金颗粒与巯基修饰的反义长链DNA和短链DNA摩尔比为1:400:800。其中，所述步骤6)NaCl溶液终浓度为5.0M。本
技术实现思路
还包括所述的核酸抗体修饰的免疫金探针在制备检测试纸条中的应用。有益效果：相对于现有技术，本专利技术具备以下优点：1)本专利技术的制备方法综合使用了点击化学技术和寡核苷酸标记纳米金颗粒技术等一系列工艺，对抗体与DNA的偶联条件，标记寡核苷酸的纳米金颗粒的制备条件进行优化，最大限度地提高标记在纳米金颗粒上的寡核苷酸的稳定性，以该方法制备的新型金纳米探针可以用于具有细胞靶向性的特异性检测，病毒的可视化检测，制备超灵敏的检测试纸条，相较于现有技术，以本专利技术制备的产品具有特异性高，稳定性好，应用领域广泛等特点，加之工艺简便，成本较低，因此有很好的推广前景。2)本专利技术反应条件十分温和，不会影响核酸与蛋白质活性，该探针在溶液中的分散度也很好，利用”盐老化“的办法，在球形核酸周围形成高盐浓度区，屏蔽了探针之间的静电吸附力。该技术可拓展到许多其他抗体和靶向物质，对癌症等一些疾病的治疗以及病原的特异性检测提供了新的技术路线和研究思路。附图说明图1是实施例1制备的探针的SDS-PAGE佐证图，其中M是Marker，1是2μg抗体，2是20μg新型金纳米探针，3是金探针样品离心后的上清悬液；图2是实施例1制备的探针的TEM表征图；图3是实施例1制备的探针结合EV71病毒颗粒的TEM表征图；图4是裸金颗粒制备的免疫金探针的TEM表征图。具体实施方式以下为本专利技术的优选实施方式，仅用于解释本专利技术，而非用于限制本专利技术，且由该说明所作出的相关改进都属于本专利技术所附权利要求所保护的范围。实施例11、材料与设备1)15nm纳米金颗粒采购自东纳生物材料有限公司2)炔基修饰的长链DNA、短链DNA、巯基修饰的反义长链DNA采购自Takara公司，其序列分别为：—CHCH:TTTATATAGAGGAGTTTTTTTTTT，TTTTTTTTTT，—SH:CTCCTCTATATAAATTTTTTTTTTTT3)71型肠道病毒抗体(ab36367)采购自Abcam公司；4)硫酸铜(C112396)，异抗坏血酸钠(S105024)，THPTA(762342-100MG)(三(3-羟丙基三唑甲基)胺)，氨基胍本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸抗体修饰的免疫金探针，其特征在于，所述的免疫金探针包括纳米金颗粒核心和表面修饰的核酸抗体结合物，所述核酸抗体结合物中的核酸为炔基修饰的长链DNA，所述长链DNA的核苷酸序列为：TT TAT ATA GAG GAG TTTTT TTTTT。

【技术特征摘要】
1.一种核酸抗体修饰的免疫金探针，其特征在于，所述的免疫金探针包括纳米金颗粒核心和表面修饰的核酸抗体结合物，所述核酸抗体结合物中的核酸为炔基修饰的长链DNA，所述长链DNA的核苷酸序列为：TTTATATAGAGGAGTTTTTTTTTT。2.根据权利要求1所述的核酸抗体修饰的免疫金探针，其特征在于，所述纳米金颗粒核心为结合了巯基修饰的反义长链DNA和短链DNA的纳米金颗粒，所述反义长链DNA的核苷酸序列为CTCCTCTATATAAATTTTTTTTTTTT，所述短链DNA的核苷酸序列为TTTTTTTTTT。3.根据权利要求1所述的核酸抗体修饰的免疫金探针，其特征在于，所述纳米金颗粒的粒径为15~30nm。4.权利要求1~3任一项所述的核酸抗体修饰的免疫金探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将抗体和叠氮化合物按一定比例混合，在室温环境下，摇晃结合一定时间得到样品；2）将步骤1）结合后的样品吸出，加入透析袋放置于PBS中透析过夜得到抗体叠氮结合物；3）将透析过夜的抗体叠氮结合物取出，加入炔基修饰的长链DNA和催化剂，室温下摇晃结合得到核酸抗体结合物；4）将结合好的核酸抗体结合物再次加入透析袋，放置于PBS中，透析过夜，中间换一次透析液，获得背景较为干净的核酸抗体结合物；5）将纳米金颗粒与巯基修饰的反义长链DNA和短链DNA按一...

【专利技术属性】
技术研发人员：周昕，袁嘉晟，张天宇，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32