一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其包括检测抗体、包被板以及包被在所述包被板上的检测抗原；其中，所述包被检测抗原为p72蛋白，所述检测抗体为经辣根过氧化物酶标记的抗p72蛋白单克隆抗体。本发明专利技术提供的用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其检测方法简单，检测成本低，检测灵敏度高，特异性好。特异性好。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟病毒(Africa swine fevervirμs，ASFV)是引起家猪和野猪发病的一种急性、和高传染性的疾病，ASFV可经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或是扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴和血液遍布全身。强毒感染时细胞变化很快，在呈现明显的刺激反应前，细胞都已死亡。弱毒感染时，刺激反应很容易观察到，细胞核变大，普遍发生有丝分裂。发病率通常在40％
‑
85％之间，死亡率因感染的毒株不同而有所差异。高致病性毒株死亡率可高达90
‑
100％；中等致病性毒株在成年动物的死亡率在20％
‑
40％之间，在幼年动物的死亡率在70％
‑
80％之间；低致病性毒株死亡率在10％
‑
30％之间。
[0003]世界动物卫生组织主要采用分子生物学方法检测非洲非洲猪瘟病毒，主要是各种PCR的方法，包括荧光PCR、等温介导的PCR等。PCR的方法灵敏度高，特异性好，但是需要专门的PCR仪、专业的实验人员以及专门的实验室。很多时候会因为气溶胶的污染导致全部待测样品假阳性结果的出现。
[0004]综上，目前对猪瘟病毒的检测方法，容易出现假阳性，检测仪器复杂，操作繁琐，亟待研发一种新型的对猪瘟病毒的检测方法。

技术实现思路
/>[0005]为此，本专利技术提供一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术实施例提供一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其包括检测抗体、包被板以及包被在所述包被板上的检测抗原；
[0008]其中，所述包被检测抗原为p72蛋白，所述检测抗体为经辣根过氧化物酶标记的抗p72蛋白单克隆抗体。
[0009]本专利技术的一个实施例中，所述抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173，保藏地址为：中国武汉
‑
武汉大学。
[0010]本专利技术的一个实施例中，所述酶联免疫试剂盒中，还含有如下中的至少一种：酶标板、包被液、辣根过氧化物酶标记的亲和素、样品稀释液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液。
[0011]本专利技术的一个实施例中，所述包被液为0.05M碳酸盐缓冲液；
[0012]所述样品稀释液为PBS缓冲液；
[0013]所述显色液为四甲基联苯胺；
[0014]所述封闭液为用PBS溶液配制5％酪蛋白溶液；
[0015]所述终止液为1M硫酸。
[0016]本专利技术的一个实施例中，所述检测抗原的包被浓度为0.33μg/ml。
[0017]本专利技术的一个实施例中，所述检测抗原的包被温度为4℃，包被时间为 16
‑
18h；
[0018]或所述检测抗原的包被温度为37℃，包被时间为1
‑
2h。
[0019]本专利技术的一个实施例中，所述试剂盒还包括阳性血清和阴性血清。
[0020]上述所述的抗p72蛋白单克隆抗体，也属于本专利技术的保护范围。
[0021]上述所述的抗p72蛋白单克隆抗体在所述的酶联免疫试剂盒的应用，也属于本专利技术的保护范围。
[0022]本专利技术具有如下优点：
[0023]试验证明：本专利技术的用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其检测方法简单，检测成本低，检测灵敏度高，特异性好。
具体实施方式
[0024]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]本专利技术中，PBST洗涤液(1X)：氯化钠8g，氯化钾0.2g，Na2HPO
4 12H2O2.9g，KH2PO
4 0.2g，吐温
‑
20 500μL，补足水至1000mL。
[0026]样品稀释液为PBS液：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠12H2O2.9g，磷酸二氢钾0.2g，补足水至1000mL。
[0027]终止液：2M硫酸溶液，取浓硫酸178.3mL，补足浓硫酸至200mL。
[0028]包被液：0.05M碳酸盐缓冲液，pH值为9.6：Na2CO
3 0.795g，NaHCO
3 1.47g，溶于蒸馏水定容至500mL。
[0029]洗涤液：NaH2PO4·
12H2O 68.8g,Na2HPO
4 6.9g，NaCl 45g，Tween
‑
20 500 μL，加双蒸水至1000mL，pH值7.4。
[0030]封闭液：用PBS溶液配制5％酪蛋白溶液，4℃保存。
[0031]实施例1、鼠抗非洲猪瘟病毒p72蛋白的单克隆抗体的制备
[0032]1、腹水的制备
[0033]本实施例采用的杂交瘤细胞，抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173，保藏地址为：中国武汉
‑
武汉大学。
[0034]对8
‑
12周龄Balb/c雄性小鼠进行腹腔注射适量(500μL
‑
1mL)的弗氏不完全佐剂，1周后，将处理好的阳性杂交瘤细胞按照106‑
108个/ml比例进行腹腔注射，500μL/只。每日观察小鼠状态，待小鼠腹部出现明显的膨胀后，注射器吸取小鼠腹水，并进行4℃，10000g离心5
‑
10min，
‑
20℃保存备用。
[0035]2、鼠抗p72蛋白单克隆抗体的纯化
[0036]因链球菌蛋白A(Protein A)能与抗体的Fc区发生特异性的结合，该亲和介质可以用于抗体的分离纯化。因此，采用Protein A试剂盒说明书，对上述制备的腹水进行IgG抗体的纯化，得到鼠抗p72蛋白单克隆抗体。
[0037]实施例2、非洲猪瘟病毒抗体竞争ELISA检测条件优化
[0038]将实施例1制备的抗p72蛋白单克隆抗体用HRP酶标记，得到抗p72蛋白单克隆抗体
‑
HRP(货号ld089，山东绿都生物科技有限公司)。
[0039]将包被板用检测抗原为p72蛋白抗原(货号LD
‑
DW
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于包括检测抗体、包被板以及包被在所述包被板上的检测抗原；其中，所述包被检测抗原为p72蛋白，所述检测抗体为经辣根过氧化物酶标记的抗p72蛋白单克隆抗体。2.如权利要求1所述的用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173，保藏地址为：中国武汉
‑
武汉大学。3.如权利要求1所述的用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒中，还含有如下中的至少一种：酶标板、包被液、辣根过氧化物酶标记的亲和素、样品稀释液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液。4.如权利要求1所述的用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述包被液为0.05M碳...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐世云，刘捷，于金枝，武玉香，谭静，沈志强，
申请(专利权)人：山东绿都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：