快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒及其制备方法，方法包括：S1.制备包被有植物乳杆菌悬液的微孔板：挑取植物乳杆菌干粉经复苏、传代培养，再经离心加入冷冻干燥保护剂制备菌悬液，菌悬液加入到微孔板微孔中经真空冷冻干燥实现包被，其中，冷冻干燥保护剂按质量分数计由9％‑10％的脱脂奶粉、4％‑5％的乳糖及12％‑15％的D‑山梨糖醇配制而成；S2.制备维生素B7标准品；S3.制备维生素B7培养基。与现有方法相比，本发明专利技术简化了准备菌种步骤，缩短了检测时长，降低了菌种在传代、保存以及活化过程中发生突变、污染可能性，使菌株活力稳定性提高，保证实验结果的可靠性和有效性，符合目前快速检测的要求。

A Kit for Rapid Detection of Vitamin B7 in Dairy Products and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及食品检测领域，尤其涉及一种快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
维生素B7是一种水溶性维生素。主要作用为促进蛋白质、脂肪等营养物质的代谢，为人体活动提供能量。目前，众多的乳品会选择添加维生素B7来提高营养价值。如今检测乳品中维生素B7的方法众多，例如高效液相色谱法、ELISA法、分光光度法、微生物法以及液质联用法等。分光光度法灵敏度差，而且基质干扰较大，因此仅适用于检测基质简单，且维生素B7含量高的样品。酶联免疫法干扰因素较多，常会导致结果不稳定，重复性不好。高效液相色谱法对成分复杂、色素较多、杂质干扰大的样品分离效果不好。而超高效液相色谱-质谱联虽然检测结果稳定，但用法成本高，且整个过程费时费力，样品前处理十分烦琐。因此目前检测奶粉中的维生素B7的方法一般是依据国标法GB5009.259—2016进行，但是此方法每次需要活化菌种，每月还需要传种一次，再制备多个不同稀释倍数的菌悬液，准备工作比较多，需要两天准备菌种，花费时间长，不适合快速检测的要求。因此，现有技术还有待进一步发展。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术实施例提供了一种快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒及其制备方法，以解决现有检测方法无法快速检测乳品中维生素B7的问题。本专利技术维生素B7检测试剂盒的制备包括以下步骤：(1)制作包被有ATCC8014菌悬液的微孔板：a.培养基配制：配制加入番茄汁的细菌液体培养基和加入番茄汁的琼脂培养基，分装、按要求灭菌、倒平板、冷却备用；b.菌种复苏：挑取植物乳杆菌ATCC8014干粉少许接入细菌5毫升或10毫升液体培养基中，37℃温箱培养1天；c.配制冷冻干燥剂：将9％-10％脱脂奶粉、4％-5％乳糖及12％-15％D-山梨糖醇称量好后，加入相应的水，然后沸水浴至完全溶解，冷水浴冷却至室温，细菌过滤器过滤后待用；d.细菌传代：将b培养的菌再转接到相应的液体培养基，37℃温箱培养16-20小时用于制作菌悬液；e.菌悬液制备：将d培养的菌取5mL于离心管，4000r/min离心3-5min，弃上清，加入5mL无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，再加入5mL无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，再加入5mL无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，加入250微升冷冻干燥保护剂溶解沉淀，混匀后再用冷冻干燥保护剂稀释20-40倍，混匀，取该菌悬液120微升加入到微孔中酶标仪630nm测OD值为0.2左右即可作为包被用的菌悬液。f.将制备好的菌悬液1ul/孔加入到微孔板微孔中，置事先预(预冻程度基本是预冻2小时，冷井温度-50℃左右，样品温度-20℃左右)冻好的冷冻干燥机的冷井中预冻1小时；1小时后，关闭气阀，打开真空泵开关，同时关闭冷冻开关，0.5小时候关掉真空泵，打开气阀放气，再关闭气阀，打开真空泵，15分钟后关闭真空泵，打开气阀放气；将冷井中的板转移到上层，关闭气阀，打开真空泵，直至抽干(大概需要1.5小时以上)，中途可打开拿出板在超净工作台用灭菌枪头戳一戳，直至比较硬；将板放铝箔袋中，放入干燥剂，密封，置冰箱冷藏保存。上述使用的微孔板为Costar板，所用菌种为ATCC8014。(2)制备维生素B7标准品a.取10微升40ppb标准品于棕色玻璃瓶(容积大于2毫升)，真空条件下干燥即得到干燥的标准品，可长时间冷藏(最少半年)保存；b.临使用时先加2毫升无菌术或纯水溶解并用细菌过滤器过滤得到约2毫升浓度为0.2ppb的标准品，足够稀释一次实验使用的标准曲线的用量，再按照说明书上的方法稀释成所需要的浓度后可直接使用。上述使用的维生素B7标准品为D-维生素B7标准品99％，CatNO:322564Lot:L930Q151CAS:58-85-5。(3)制备维生素B7培养基a.培养基与水的比例为3:40，现用现配；b.称取培养基溶解后95℃水浴5分钟；c.冷水或冰水浴迅速降温至室温；d.细菌过滤器过滤后可直接使用。上述使用的维生素B7培养基为：BD品牌Lot：7109549。上述方法制备的维生素B7检测试剂盒中包含以下物品：1个96孔微孔板(带菌种)、3瓶无菌蒸馏水(30mL)，用于准备培养基和样品提取稀释液、2瓶40*浓缩样品提取液、3瓶维生素B7培养基(固态)、2瓶维生素B7标准品、3个粘合箔、1个微孔板框。本专利技术维生素B7检测试剂盒检测可得到的相关参数如下：标准范围0、160、320、480、640、800ng/100g(mL)；参考标准品的回收率达80-115％；检测底限为0.1μg/100g；板间CV值≤10％；板内CV值≤10％。与GB5009.259-2016中所述方法相比，本专利技术利用了冻干菌易于保存的优点，简化了菌种传代活化的工艺，同时降低了因菌种传代等过程引起的突变、污染等问题的风险。与其他现有的检测维生素B7试剂盒相比，本专利技术所用的复合冷冻干燥剂可以提高植物乳杆菌的存活率，经检测，存活率可达90％～95％，此外植物乳杆菌因适应不利环境而发生的重组或变异可能性也随之降低，使得检测结果更加准确可信。而且本专利技术重复性好，回收率高，检测结果稳定，可信度高。并且整个检测维生素B7的时长因减去了繁杂的工艺而大大缩短，可以达到快速检测的要求。另外本专利技术利用了酶标仪同时测定多个样品吸光度的优点，比起国标法的分光光度计更加省时、快捷。附图说明图1为本专利技术实施例中利用维生素B7标准品配置的标准曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1快速检测乳品中维生素B7含量的试剂盒制备具体步骤包括：1.制备菌悬液(1)番茄汁制备：将番茄去皮后用料理机打碎搅匀，纱布过滤，取干净的滤液备用；(2)将9％-10％脱脂奶粉、4％-5％乳糖及12％-15％D-山梨糖醇按比例配制作为冷冻干燥保护剂，加入相应的水，然后沸水浴至完全溶解，冷水浴冷却至室温，细菌过滤器过滤后待用；(3)培养基配制：配制细菌液体培养基和琼脂培养基(别忘记加番茄汁)，分装、按要求灭菌、倒平板、冷却备用；(4)菌种复苏：挑取植物乳杆菌ATCC8014干粉少许接入细菌5毫升或10毫升液体培养基中，37℃温箱培养1天；(5)细菌传代：将(3)培养的菌再转接到相应的液体培养基，37℃温箱培养16-20小时，这次的液体培养基的量可以稍微多一点，一部分用于制作菌悬液，一部分用于传代，大部分用于菌种保存；(6)平板传代保存：将(4)培养的细菌稀释一定倍数后涂平板，37℃温箱培养2-3天，再冷藏保存，1个月传一次；(7)菌种甘油保存：将(4)培养的菌取部分加入等体积的50％的甘油(灭菌的)，混匀后分装于冻存管，置-20℃保存；(8)菌悬液制备：将(4)培养的菌取5mL于离心管，4000r/min离心3-5min，弃上清，加入5mL无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，再加入5mL无菌水4000r/min离心3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1.制备包被有植物乳杆菌悬液的微孔板：挑取植物乳杆菌干粉经复苏，传代培养后，再经离心去上清并向离心后产物中加入冷冻干燥保护剂来制备菌悬液，将制备好的菌悬液加入到微孔板微孔中，经真空冷冻干燥实现微孔中植物乳杆菌悬液包被，其中，冷冻干燥保护剂由9％‑10％质量分数的脱脂奶粉、4％‑5％质量分数的乳糖及12％‑15％质量分数的D‑山梨糖醇加水溶解配制而成；S2.制备维生素B7标准品；S3.制备维生素B7培养基。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1.制备包被有植物乳杆菌悬液的微孔板：挑取植物乳杆菌干粉经复苏，传代培养后，再经离心去上清并向离心后产物中加入冷冻干燥保护剂来制备菌悬液，将制备好的菌悬液加入到微孔板微孔中，经真空冷冻干燥实现微孔中植物乳杆菌悬液包被，其中，冷冻干燥保护剂由9％-10％质量分数的脱脂奶粉、4％-5％质量分数的乳糖及12％-15％质量分数的D-山梨糖醇加水溶解配制而成；S2.制备维生素B7标准品；S3.制备维生素B7培养基。2.根据权利要求1所述的快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所用植物乳杆菌菌种为ATCC8014。3.根据权利要求1所述的快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤S1还包括：菌种复苏前预先配制加入番茄汁的细菌液体培养基，预先配置加入番茄汁的琼脂培养基，并分装、灭菌、倒平板、冷却备用。4.根据权利要求3所述的快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，挑取植物乳杆菌干粉复苏的具体方法为：挑取植物乳杆菌ATCC8014干粉少许接入5毫升或10毫升细菌液体培养基中，37℃温箱培养1天。5.根据权利要求4所述的快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，菌种复苏后的传代培养具体方法为：将复苏后的菌种再转接到细菌液体培养基中，于37℃恒温箱培养16-20小时。6.根据权利要求5所述的快速检测乳品中维生素B7的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，取传代培养的菌液5mL于离心管，4000r/min离心3-5min，弃上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓兴朝，陈欢，林金昌，崔让莲，曾祥富，
申请(专利权)人：深圳容金科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44