一种检测乳品中维生素B9含量的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测乳品中维生素B9含量的试剂盒及其制备方法，方法包括：S1.制备菌悬液包被微孔板：将乳杆菌菌种复苏后，经多次离心去上清后，向离心后产物中加入冷冻干燥保护剂来制备菌悬液，将菌悬液加入到微孔板微孔中，经真空冷冻干燥实现微孔中菌悬液包被；S2.制备维生素B9标准品；S3.制备维生素B9测定培养基：本发明专利技术的检测试剂盒法只需处理样品、制备培养基和标准品孵育就可进行检测，检测周期缩短。通过冷冻保护剂及真空干燥降低了试剂盒中的菌种损失，提高维生素B9检测结果的准确性，并且试剂盒配备各浓度标准品，降低了实验误差，本发明专利技术检测试剂盒稳定、重复高、回收率高。

【技术实现步骤摘要】
一种检测乳品中维生素B9含量的试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及食品检测领域，尤其涉及一种检测乳品中维生素B9含量的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
维生素B9(folicacid)，是一种水溶性维生素。由蝶呤啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成的化合物，也叫蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid，PGA)，它是B族维生素的一种，人体本身不能合成。1941年，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化并被命名为维生B9。研究表明，维生素B9缺乏易引起习惯性流产、胎儿畸形、无脑儿、死胎、早产、胚胎停育等非正常妊娠的产生。同时也与新生儿白血病等癌症，以及儿童智力低下有关。而摄入过量维生素B9会产出毒副作用，如神经受损、发育缓慢、降低食欲等，偶可见过敏反应。由于维生素B9是目前很多食品中添加的重要的营养添加剂，因此维生素B9也越来越受到人们的重视，其相关研究领域正逐渐拓宽，因此食品中维生素B9浓度的检测会更加受到关注，其检测技术也会不断更新与发展。目前生物体、食品中维生素B9的测定多采用微生物法、比色法、同位素放射免疫法或色谱法、色-质联用法，但这些方法对于维生素B9的检测都有一定的局限性。放射免疫法可用于检测和评价维生素B9的营养状况但不适用于检测单谷氨酸维生素B9衍生混合物。从定量检测的角度来讲，难以得到准确的维生素B9质量分数值。比色法一般用来测定原料维生素B9、纯酸制品或药品制剂中的维生素B9质量分数。气相色谱-质谱检测主要用于检测血清或红细胞中的维生素B9，但对检出限有一定的要求。微生物法是国际和国内普遍采用的方法，中国食品安全国家标准GB5009.211—2014也将生物法作为维生素B9检测的首选方法。是利用了微生物对某些维生素的特殊依赖性，通过观察微生物的生长繁殖速度来间接测定维生素的含量，同时微生物法具有较高的灵敏度，检测准确度高，先期投人少、检测成本低、见效快的优点但此法存在分析周期长，实验步骤稍烦琐的问题，传统微生物法先需将微生物孵育24h然后进行针刺接种后孵育24h，再处理样品、制备培养基和标准品，孵育24-48h，方可进行结果检测，检测周期5-6天。而且影响微生物法测定维生素B9的因素也较多，使用的营养缺陷型微生物，菌株活力存在差异均匀状态不好活力稳定性差并且在实验过程中使用的玻璃器具、样品称量、稀释的准确度、环境设施、检测结果受样品中所含抗维生素B9药物或抗生素成分等都会影响测定结果。甚至出现微生物为了适应不利环境易发生变异或重组，直接导致错误的结果。因此，现有技术还有待进一步发展。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术实施例提供了一种检测乳品中维生素B9含量的试剂盒及其制备方法，以解决现有检测方法简单准确地检测乳品中维生素B9含量的问题。本专利技术试剂盒制作过程如下：1、含冻干菌的酶标板:Costar板，包被物：维生素B9试剂盒所用的菌种是鼠李糖乳杆菌ATCC7469菌株。菌悬液制备：(1)番茄汁制备：将番茄去皮后用料理机打碎搅匀，纱布过滤，取干净的滤液备用。(2)冷冻干燥保护剂配制：0.07g脱脂奶粉+1.2g蔗糖+0.1g谷氨酸钠(味精)+加无菌水至10mL，无菌过滤器过滤后用于稀释菌液。(3)培养基配制：按说明配制细菌液体培养基和琼脂培养基(分别加番茄汁)，分装、按要求灭菌、倒平板、冷却备用。(4)菌种复苏：ATCC7469菌株菌液接50uL到细菌10mL液体培养基中，37℃温箱培养24小时。得到的菌悬液一部分用于传代和包被板孔，大部分用于菌种保存。(5)细菌传代：将(4)培养的菌再转接50uL到相应的5mL液体培养基，37℃温箱培养16-20小时。(6)平板传代保存：将(4)培养的细菌稀释一定倍数(100)后取100uL涂平板，37℃温箱培养2-3天，再冷藏保存，1个月传一次。(7)菌种甘油保存：将(4)培养的菌悬液取部分加入等体积的50％的灭菌甘油，混匀后分装于冻存管，置-20℃保存。(8)包被板孔菌悬液制备：将(4)培养的菌取5mL于离心管，4000r/min离心3-5min，弃上清，加入5mL无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，再加入5mL无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，再加入5mL无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，加入200uL无菌水溶解沉淀，混匀后再用冷冻干燥保护剂6稀释20倍，混匀，再用冷冻干燥保护剂6稀释50倍(总共1000)混匀，取该菌悬液120微升加入到微孔中酶标仪630nm测OD值为0.2左右即可作为包被用的菌悬液。冻干过程：(1)将制备好的菌悬液1.5uL/孔加入到Costar板微孔中，套上无菌袋，先置冰箱-20℃左右冷冻1小时；(2)1小时后，置于冷冻抽干器上，关闭气阀，打开真空泵开关，同时关闭冷冻开关，抽0.5小时后关掉真空泵，打开气阀放气，再关闭气阀，打开真空泵抽1小时后关闭正空泵，打开气阀放气；(3)将板放铝箔袋中，放入干燥剂，真空抽干，置冰箱冷藏保存。标准品的制备：制备标准品所用高标品为D-维生素B9标准品96％，CatNO:100986Lot:L880Q91CAS:95-30-3。(1)标准溶解：先用0.01Mol/L的NaOH/乙醇溶液溶解稀释高标品到1100ppm，再继续稀释到550ppb浓度；(2)取2.2uL550ppb标标准品于棕色玻璃瓶(容积大于2毫升)真空抽干15min,得到干燥的标准品，可长时间冷藏(最少半年)保存；每一盒提供3瓶；(3)临使用时先加2毫升无菌水溶解并用细菌过滤器过滤得到约2毫升浓度为0.6ppb的标准品，足够稀释一次实验使用的标准曲线的用量，再按照说明书上的方法稀释成所需要的浓度(0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0ppb)后可直接使用维生素B9测定培养基：海博牌维生素B9测定培养基Lot：HB7020(1)称培养基0.94g维生素B9测定培养基于干燥有缓冲液的培养基瓶，加入0.01g抗坏血酸；每一盒包含3瓶。(2)使用时加10mL无菌水溶解后在95℃水浴5分钟；冷水或冰水浴迅速降温至室温；细菌过滤器过滤后可直接使用；其中，试剂盒中包含无菌水：30ml/瓶，玻璃瓶装，经过灭菌的纯净水。包含粘合铂(封板模)：博奥通科科技有限公司提供。本专利技术的检测试剂盒法只需处理样品、制备培养基和标准品孵育就可进行检测，检测周期3天。通过冷冻保护剂以及真空干燥方法降低了试剂盒中的菌种损失，提高维生素B9检测结果的准确性，并且试剂盒配备各浓度标准品，降低了实验误差，样品前处理可与其他维生素项目同时进行测定，每个试剂盒中还配备了质控物质利于实验质量监控，试剂盒稳定、重复高、回收率高。附图说明图1为本专利技术实施例中利用维生素B9标准品配置的标准曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术试剂盒组成：96孔微孔板(包被菌种)1个、无菌蒸馏水(30mL)用于准备培养基和样品提取稀释液3瓶、维生素B9培养基(固本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测乳品中维生素B9含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1.制备菌悬液包被微孔板：将乳杆菌菌种复苏后，经多次离心去上清后，向离心后产物中加入冷冻干燥保护剂来制备菌悬液，将菌悬液加入到微孔板微孔中，经真空冷冻干燥实现微孔中菌悬液包被，其中，冷冻干燥保护剂配置标准如下：称取0.07g脱脂奶粉、1.2g乳糖及0.1g的谷氨酸钠加无菌水至10ml并经无菌过滤器过滤；S2.制备维生素B9标准品；S3.制备维生素B9测定培养基：称取维生素B9测定培养基0.94g于干燥的培养基瓶中，加入0.01g抗坏血酸，使用时加10mL无菌水溶解后在95℃水浴5分钟，冷水或冰水浴迅速降温至室温，细菌过滤器过滤后使用。

【技术特征摘要】
1.一种检测乳品中维生素B9含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1.制备菌悬液包被微孔板：将乳杆菌菌种复苏后，经多次离心去上清后，向离心后产物中加入冷冻干燥保护剂来制备菌悬液，将菌悬液加入到微孔板微孔中，经真空冷冻干燥实现微孔中菌悬液包被，其中，冷冻干燥保护剂配置标准如下：称取0.07g脱脂奶粉、1.2g乳糖及0.1g的谷氨酸钠加无菌水至10ml并经无菌过滤器过滤；S2.制备维生素B9标准品；S3.制备维生素B9测定培养基：称取维生素B9测定培养基0.94g于干燥的培养基瓶中，加入0.01g抗坏血酸，使用时加10mL无菌水溶解后在95℃水浴5分钟，冷水或冰水浴迅速降温至室温，细菌过滤器过滤后使用。2.根据权利要求1所述的检测乳品中维生素B9含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，所用乳杆菌菌种为鼠李糖乳杆菌ATCC7469菌株。3.根据权利要求2所述的检测乳品中维生素B9含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤S1还包括：菌种复苏前预先配制加入番茄汁的细菌液体培养基，预先配置加入番茄汁的琼脂培养基，并分装、灭菌、倒平板、冷却备用。4.根据权利要求3所述的检测乳品中维生素B9含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，乳杆菌菌种复苏的具体方法为：鼠李糖乳杆菌ATCC7469菌株菌液接50uL到10mL细菌液体培养基中，37℃温箱培养24小时。5.根据权利要求4所述的检测乳品中维生素B9含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，菌悬液制备具体为：取复苏后菌液5mL于离心管中，4000r/min离心3-5min，弃上清，加入5mL无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，再加入5mL无菌水4000r/min离心3...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓兴朝，陈欢，林金昌，崔让莲，曾祥富，
申请(专利权)人：深圳容金科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44