一种破伤风类毒素诱导的灵长类动物迟发型超敏反应动物模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物医学研究技术领域，特别涉及一种破伤风类毒素诱导的灵长类动物迟发型超敏反应动物模型的构建方法。该方案中包括以下步骤：以不同生物活性的破伤风类毒素疫苗作为致敏用溶液和攻击用溶液；第0d，除第1组外所有动物由4mg/kg的氯胺酮麻醉，经注射80IU/mL破伤风类毒素疫苗；在两侧大腿的肌肉内注射破伤风类毒素疫苗；4周后，用同样方法加强免疫一次；第9周，再次麻醉动物，对模型动物通过皮下注射0.1mL的破伤风类毒素疫苗进行攻击，对照组动物用不含破伤风类毒素的氢氧化铝佐剂进行攻击。本发明专利技术能够有效的建立一种非人灵长类动物迟发型超敏反应动物模型，提供与人更为相关的DTH反应进程并提高实验数据的可信度。

Establishment of an animal model of delayed hypersensitivity induced by tetanus toxoid in primates

【技术实现步骤摘要】
一种破伤风类毒素诱导的灵长类动物迟发型超敏反应动物模型的构建方法
本专利技术涉及生物医学研究
，特别涉及一种破伤风类毒素诱导的灵长类动物迟发型超敏反应动物模型的构建方法。
技术介绍
迟发型超敏反应(DTH)是典型的细胞介导的IV型超敏反应，巨噬细胞及敏化的CD4+T细胞是引起细胞及组织损伤的主要因素。人群中，DTH反应被用作经典的细胞免疫反应测试，以测试此前对特定抗原的暴露，并可简单的由皮下注射该抗原而引发。在临床前实验中，DTH动物模型被广泛用于新型免疫抑制剂和免疫调节剂的评价，以及疫苗开发的过程。毫不意外地，在啮齿类动物身上所观察到的药效往往和人类身上有很大不同。该不同主要由于用于人类的生物制剂和啮齿类动物往往不具备交叉反应性，且人类为远亲生殖，其个体差异远远大于近亲繁殖的啮齿类动物。故急需建立一种非人灵长类动物迟发型超敏反应动物模型，来提供与人更为相关的DTH反应进程并提高实验数据的可信度。
技术实现思路
鉴于以上问题，本专利技术提供了一种破伤风类毒素诱导的灵长类动物迟发型超敏反应动物模型的构建方法，来提供与人更为相关的DTH反应进程并提高实验数据的可信度。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种破伤风类毒素诱导的灵长类动物迟发型超敏反应动物模型的构建方法，包括以下步骤：首先将动物分为两组：第1组为正常对照组，第2组为模型组。以破伤风类毒素疫苗作为致敏用溶液；将破伤风类毒素疫苗用1.5mg/mL的氢氧化铝佐剂稀释后混匀，作为攻击用溶液；第0d，除第1组外所有动物由4mg/kg的氯胺酮麻醉，经注射80IU/mL破伤风类毒素疫苗，在麻醉效果不理想的情况下，使用含1.5-5％异氟烷的0.8-1.5L/min氧气做进一步吸入麻醉；在两侧大腿的肌肉内注射破伤风类毒素疫苗；4周后，用同样方法加强免疫一次；第9周，再次麻醉动物，除第1组外，其余动物均通过皮下注射0.1mL的破伤风类毒素疫苗进行攻击，注射位点在腹部两侧，每侧5点，平行排列，第1组的动物用不含破伤风类毒素的氢氧化铝佐剂进行攻击。所述作为致敏用溶液破伤风类毒素疫苗的生物活性为80IU/mL。所述攻击用溶液的破伤风类毒素疫苗稀释为25IU/mL。所述在两侧大腿的肌肉内注射的破伤风类毒素疫苗的量为1.0mL，且每侧0.5mL。本专利技术提供了与人更为相关的DTH反应进程并提高实验数据的可信度中的应用。本专利技术的优点和有益效果在于：提供一种非人灵长类动物迟发型超敏反应动物模型，来提供与人更为相关的DTH反应进程并提高实验数据的可信度。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为注射位点红斑，水肿和皮肤硬化评分。**p<0.01造模后与正常动物相比。图2为病理评分，数据表示为平均值±标准误。**p<0.01造模后与正常动物相比(非参数重复测量方差分析)。图3为免疫组化评分，数据表示为平均值±标准误。**p<0.01造模后与正常动物相比(非参数重复测量方差分析)。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1.实验设备、材料及溶液的制备破伤风类毒素疫苗(氢氧化铝吸附破伤风类毒素，～40IU/0.5mL，武汉生物制品所)，氢氧化铝佐剂(1.5mg/mL，Sigma-Aldrich，货号：239186)、异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、氯胺酮(福建古田药业，货号：101221)、甲苯噻嗪(东京化成工业株式会社，货号：70-A)、所选饮水为经净水器净化后的自来水，符合WHO饮用水规范。数显游标卡尺(FisherScientific，货号：06-664-16)、皮肤活检冲(Zivic，PUN5000型)、匀浆器(转速设置为30000rpm，IKA仪器设备有限公司)、多功能酶标仪(TECANInfiniteM200)。表1实验动物信息表动物品系食蟹猴英文名MacacaFascicularis动物处理历史无性别，年龄和体重雌性，3–4岁，2.5–3.3kg动物数量10供应商广西桂东灵长类开发实验有限公司实验场地澎立生物医药技术(上海)有限公司适应期不少于14d饲养间普通级动物房室温20–29℃相对湿度40-70％灯光循环荧光灯12h循环动物饲养1只每笼食物自由取食饮水自由饮水实验所选用的动物处理信息如上表1所示，该实验所有操作步骤均经由澎立生物医药技术(上海)有限公司的动物管理和使用委员会(IACUC)审阅及批准。实施例2.DTH反应的诱发首先对实验动物由体重进行随机分组，具体组别及给药信息如表2所示。表2实验组别给药信息表以破伤风类毒素疫苗(80IU/mL)作为致敏用溶液；将80IU/mL的破伤风类毒素疫苗用1.5mg/mL的氢氧化铝佐剂稀释为25IU/mL，并混匀，作为攻击用溶液。第0d，除第一组外，所有动物由4mg/kg的氯胺酮麻醉，经注射80IU/mL破伤风类毒素疫。如有必要，使用含1.5-5％异氟烷的0.8-1.5L/min氧气做进一步吸入麻醉；在两侧大腿的肌肉内注射1.0mL的破伤风类毒素疫苗，每侧0.5mL。4周后，用同样方法加强免疫一次；第9周，如前次麻醉动物，除第1组外，其余动物均通过皮下注射0.1mL的25IU/mL的破伤风类毒素疫苗进行攻击。注射位点在腹部两侧，每侧5点，平行排列。第1组的动物用不含破伤风类毒素的氢氧化铝佐剂进行攻击作为对照组。实施例3.迟发型超敏反应的评价3.1发病率每组发生皮肤硬化的动物数及每只动物发生硬化的注射位点数将被记录下来。注射位点如果有副反应发生，如起泡或溃疡等也做记录。动物每天至少临床观察一次，检查有无任何疾病，抑郁或手术，治疗引起的副作用，没有相关现象被发现。3.2皮肤硬化攻击24、48和72h后，检查注射位点的皮肤硬化情况，并拍照。以游标卡尺测量每个注射位点硬块的长和宽，皮肤硬化的情况以硬化区域的面积来衡量，面积(mm2)＝长×宽。实现结果如图1所示，食蟹猴经破伤风类毒素免疫及攻击后，其皮肤皮肤的硬化面积显著增加，以上症状维持了至少72h。与正常动物相比具有显著差异。3.3红斑及水肿评分在注射前及注射后24、48及72h后，每天1次目视及触诊检查并记录皮内注射位点的皮肤变化。以如下标准对红斑进行评分：(非常轻微，勉强可见＝1；轻度＝2；中度＝3；重度可能有痂形成＝4)；水肿形成(非常轻微，勉强可见＝1；轻微的，边缘清晰，高于周围皮肤表面＝2；中度的，水肿区域高于周围皮肤表面约1mm＝3；重度的，水肿区域高于周围皮肤表面超过1mm，水肿区域面积超过皮内注射所影响的区域＝4)。实现结果如图1所述，食蟹猴经破伤风类毒素免疫及攻击后，其皮肤产生了明显的红斑和水肿，以上症状维持了至少72h。与正常动物相比具有显著差异。3.4全血细胞计数攻击的-24、0、24、48、72h后进行全血细胞计数。3.5病理切片动物用异氟烷麻醉，通过皮肤冲在注射位点取样。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种破伤风类毒素诱导的灵长类动物迟发型超敏反应动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将动物分为两组：第1组为正常对照组，第2组为模型组；以破伤风类毒素疫苗作为致敏用溶液；将破伤风类毒素疫苗用1.5mg/mL的氢氧化铝佐剂稀释后混匀，作为攻击用溶液；第0d，除第1组外所有动物由4mg/kg的氯胺酮麻醉，经注射80IU/mL破伤风类毒素疫苗，在麻醉效果不理想的情况下，使用含1.5‑5％异氟烷的0.8‑1.5L/min氧气做进一步吸入麻醉；在两侧大腿的肌肉内注射破伤风类毒素疫苗；4周后，用同样方法加强免疫一次；第9周，再次麻醉动物，除第1组外，其余动物均通过皮下注射0.1mL的破伤风类毒素疫苗进行攻击，注射位点在腹部两侧，每侧5点，平行排列，第1组的动物用不含破伤风类毒素的氢氧化铝佐剂进行攻击。

【技术特征摘要】
1.一种破伤风类毒素诱导的灵长类动物迟发型超敏反应动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将动物分为两组：第1组为正常对照组，第2组为模型组；以破伤风类毒素疫苗作为致敏用溶液；将破伤风类毒素疫苗用1.5mg/mL的氢氧化铝佐剂稀释后混匀，作为攻击用溶液；第0d，除第1组外所有动物由4mg/kg的氯胺酮麻醉，经注射80IU/mL破伤风类毒素疫苗，在麻醉效果不理想的情况下，使用含1.5-5％异氟烷的0.8-1.5L/min氧气做进一步吸入麻醉；在两侧大腿的肌肉内注射破伤风类毒素疫苗；4周后，用同样方法加强免疫一次；第9周，再次麻醉动物，除第1组外，其余动物均通过皮下注射0.1mL的破伤风类毒素疫苗进行攻击，注射位点在腹部两侧，每侧5点，平行排列，第1组的动物用不含破伤风类...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨楠，俞诚，杨平，曾佳，段继峰，
申请(专利权)人：澎立生物医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31