一种肿瘤疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤疫苗及其制备方法，它是为一树突状细胞（Dentritic cell Dc）和一癌干细胞混合后诱导培养制备而得，其制备方法包括如下步骤：混合、自体肿瘤相关全抗原的制备、脐血的获取、单状核细胞的获取、DC的诱导培养、DC的扩增和培养和DC疫苗的制备，本发明专利技术可用于各种离体肿瘤组织进行树突状细胞肿瘤疫苗的制备，更对于癌干细胞具有特异性的毒杀作用，以解决以肿瘤细胞为标靶的肿瘤疫苗仍存在化学治疗和放射性治疗后肿瘤耐受性提高，而复发率高和转移率高的问题，对于日后治疗的免疫排斥性低，免疫的全面性和特异性也更好，目前肿瘤疫苗的研发和肿瘤的免疫治疗均有长足的进展，肿瘤疫苗的主动免疫与T细胞治疗被动免疫相结合。

A Cancer Vaccine and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤疫苗及其制备方法
本专利技术涉及医疗
，具体为一种肿瘤疫苗及其制备方法。
技术介绍
所谓肿瘤疫苗治疗，实际上是生物治疗的一种重要手段，可通过激活机体自身的免疫而达到主动识别并有效杀死恶性肿瘤细胞的目的，具有高度特异性。肿瘤疫苗还可诱发免疫记忆细胞，产生长效免疫效应，防止肿瘤的转移和复发，因此肿瘤治疗性疫苗是一种理想的特异性主动免疫治疗手段。肿瘤疫苗以肿瘤抗原为基础，通过合适的抗原递送系统和疫苗佐剂，激活机体特异性免疫应答，包括体液免疫和细胞免疫，尤其是CD8+T细胞(杀伤性T细胞，CTLs)，产生抗肿瘤免疫应答。肿瘤疫苗的抗肿瘤免疫活性不仅在动物实验中已得到证实，目前多种肿瘤疫苗已进入临床试验阶段，美国食品和药品管理局(FDA)于2010年4月批准一种应用抗原呈递细胞激活肿瘤抗原特异性T细胞的个体化治疗PROVENGER(sipuleucel–T)用于治疗前列腺癌，重组抗原由前列腺癌组织中表达的抗原–前列腺酸性磷酸酶(PAP)与GM–CSF融合而成，活化抗原呈递细胞和树突状细胞。因此，肿瘤的疫苗治疗是一种有着广阔应用前景的肿瘤免疫治疗方法，可用于肿瘤化疗后的辅助治疗。目前正在进行临床研究的肿瘤抗原主要有：CT抗原(包括MAGE–A1，MAGE–A3，NY–ESO–1等)，癌基因(HER2/neu)，肿瘤特异性抗原以及热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)，治疗范围涉及诸如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、神经胶质瘤和肝癌等多种肿瘤。目前制约肿瘤治疗性疫苗疗效的主要因素之一是肿瘤微环境中存在抑制性细胞如Treg，以及引起T细胞无能和无应答的“刹车”分子如PD–1/PD–L1和CTL–A4的高表达，鉴于目前靶向PD–1/PD–L1、CTL–A4的抗体在临床实验中已经取得了明显抗肿瘤的疗效，因此将肿瘤疫苗与靶向T细胞抑制分子或细胞的抗体联合使用是将来肿瘤免疫治疗发展的一个方向；常规的肿瘤治疗方法包括手术治疗、放射线治疗及化疗等。肿瘤疫苗为上述治疗方法以外的另一种治疗肿瘤的方法，是透过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。树突状细胞(dendriticcell)是公认最能表达抗原的细胞，会将抗原分解后呈现给可以发挥免疫效应和杀伤功能的T细胞，令免疫系统产生反应。树突状细胞肿瘤疫苗是携带肿瘤抗原信息的功能性树突状细胞，能激活专一性T细胞产生免疫反应，发挥抗肿瘤效应和免疫记忆功能。现有技术中的树突状细胞肿瘤疫苗，都是以肿瘤细胞为标靶，即透过裂解肿瘤细胞所得到的抗原，并将该抗原负载到患者的树突状细胞上，但如此得到的树突状细胞肿瘤疫苗用于治疗癌症，往往不能解决肿瘤复发的问题，主要原因是未将肿瘤中的癌干细胞全部杀死，而造成癌组织死灰复燃的生长，甚至经由极少数的癌干细胞驱动肿瘤的形成。
技术实现思路
本专利技术提供一种肿瘤疫苗及其制备方法，可用于各种离体肿瘤组织进行树突状细胞肿瘤疫苗的制备，特别是神经胶质瘤，而所制得的树突状细胞肿瘤疫苗不仅具有毒杀肿瘤细胞的能力，更对于癌干细胞具有特异性的毒杀作用，以解决以肿瘤细胞为标靶的肿瘤疫苗仍存在化学治疗和放射性治疗后肿瘤耐受性提高，而复发率高和转移率高的问题，且本专利技术的树突状细胞肿瘤疫苗因为自体癌干细胞和自体树突状细胞，对于日后治疗的免疫排斥性低，免疫的全面性和特异性也更好，目前肿瘤疫苗的研发和肿瘤的免疫治疗均有长足的进展，肿瘤疫苗的主动免疫与T细胞治疗被动免疫相结合，可以有效解决上述
技术介绍
中的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种肿瘤疫苗，它是为一树突状细胞和一癌干细胞混合后诱导培养制备而得。一种肿瘤疫苗制备方法，包括如下步骤：1）混合：先对一肿瘤组织进行原代分离和培养得到肿瘤细胞；以流式细胞仪自该肿瘤细胞筛选具有特定细胞表面抗原的癌干细胞；将所得到的该癌干细胞照射放射线；分离树突状细胞；将该树突状细胞与步骤所得的该癌干细胞共同培养，得到混合液；2）自体肿瘤相关全抗原的制备：手术切除的新鲜肿瘤组织：取肿瘤周边部分组织0.3-1.0cm³，剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；胸、腹水获得的肿瘤细胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm离心，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得肿瘤单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；同组织来源细胞株：反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；取以上自体肿瘤裂解物蛋白和同源细胞株裂解物蛋白各50%，混合制备成自体肿瘤相关全抗原；3）脐血的获取：产妇选择：选择足月或早产剖腹产健康妇女，应符合以下条件：年龄35岁以下；无恶性肿瘤；无遗传性疾病；无肝炎、梅毒、艾滋等传染性疾病；无严重妊娠并发症；无家族性遗传病；无孕期输血史等；胎儿选择：胎儿体重超过3000g；无先天性疾病或畸形；采血禁忌症：胎盘剥离超过12小时；胎膜早破超过24小时；羊水检测发现染色体异常；生产时产妇有感染、发热；胎儿呼吸窘迫；羊水中有胎粪等；胎儿剖出后5分钟内，距胎儿5-7cm处双重结扎胎儿侧脐带并于两线间切断，75%酒精消毒断端，胎盘侧脐带2-3cm行75%酒精消毒，一次性采血器脐静脉穿刺抽取脐血；采血完成后，尽快18℃保存箱内输送到GMP实验室，并在6小时内进行细胞分离，最晚不能超过12个小时；4）单状核细胞的获取：将上述脐血按1:1体积比加入0.01M，PH=7.4的PBS稀释，200目筛网过滤，重悬于含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管中，2500r/min梯度密度离心20分钟，仔细抽吸白膜层获取UCB-MNCs；5）DC的诱导培养：UCB-MNCs分别生理盐水离心洗涤3次，接种于塑料培养瓶，在含有5%自体血清的IMDM培养基中贴壁1.5小时，移除CD14+细胞，收集悬浮细胞，按照106/ml的细胞密度接种于培养瓶，在含有FLT3-L25ng/ml，TPO10ng/ml，SCF20ng/ml，以及5%自体血清的IMDM培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度培养2周，每2-3天换液，80%融合时移瓶，第14天收获前体DC，可冻存备用，可继续诱导未成熟DC养；6）DC的扩增和培养：前体DC接种于含有5%自体血清的IMDM培养基2ml的6孔板，细胞密度调整为3×105/well，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中贴壁培养1.5小时，移除悬浮细胞，贴壁细胞为未成熟DC，加入GM-CSF50ng/ml，IL-420ng/ml，37℃、5%CO2饱和湿度培养，每2-3天半量换液，第5天完成未成熟DC的扩增，可冻存备用，可继续成熟培养；7）DC疫苗的制备：第5天加入自体肿瘤相关全抗原50µg/ml、TNF-α100ng/ml、及CD40L100ng/ml，并补充10%的自体血清，培养48小时，诱导DC成熟并制备成肿瘤特异性DC疫苗，临床接种治疗或冻存。根据上述技术方案，所述癌干细胞为自体癌干细胞。根据上述技术方案，所述癌干细胞为CD133阳性细胞。根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤疫苗，其特征在于：它是为一树突状细胞和一癌干细胞混合后诱导培养制备而得。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤疫苗，其特征在于：它是为一树突状细胞和一癌干细胞混合后诱导培养制备而得。2.一种肿瘤疫苗制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1）混合：先对一肿瘤组织进行原代分离和培养得到肿瘤细胞；以流式细胞仪自该肿瘤细胞筛选具有特定细胞表面抗原的癌干细胞；将所得到的该癌干细胞照射放射线；分离树突状细胞；将该树突状细胞与步骤所得的该癌干细胞共同培养，得到混合液；2）自体肿瘤相关全抗原的制备：手术切除的新鲜肿瘤组织：取肿瘤周边部分组织0.3-1.0cm³，剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；胸、腹水获得的肿瘤细胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm离心，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得肿瘤单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；同组织来源细胞株：反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；取以上自体肿瘤裂解物蛋白和同源细胞株裂解物蛋白各50%，混合制备成自体肿瘤相关全抗原；3）脐血的获取：产妇选择：选择足月或早产剖腹产健康妇女，应符合以下条件：年龄35岁以下；无恶性肿瘤；无遗传性疾病；无肝炎、梅毒、艾滋等传染性疾病；无严重妊娠并发症；无家族性遗传病；无孕期输血史等；胎儿选择：胎儿体重超过3000g；无先天性疾病或畸形；采血禁忌症：胎盘剥离超过12小时；胎膜早破超过24小时；羊水检测发现染色体异常；生产时产妇有感染、发热；胎儿呼吸窘迫；羊水中有胎粪等；胎儿剖出后5分钟内，距胎儿5-7cm处双重结扎胎儿侧脐带并于两线间切断，75%酒精消毒断端，胎盘侧脐带2-3cm行75%酒精消毒，一次性采血器脐静脉穿刺抽取脐血；采血完成后，尽快18℃保存箱内输送到GMP实验室，并在6小时内进行细胞分离，最晚不能超过12个小时；4）单状核细胞的获取：将上述脐血按1:1体积比加入0.01M，PH=7.4的PBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨涛，刘凌云，
申请(专利权)人：上海市浦东医院复旦大学附属浦东医院，
类型：发明
国别省市：上海,31