Mir3061基因Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法与应用。所述构建的小鼠基因为Rosa26

【技术实现步骤摘要】
Mir3061基因Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法与应用
本专利技术涉及生物技术，具体涉及利用CRISPR/Cas9技术，获得可进行条件性过表达Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法与应用。
技术介绍
卵巢早衰(POF)是导致女性不孕的主要原因之一，其很大程度上与卵巢颗粒细胞的老化和凋亡直接导致各级卵泡质量下降有关。由于目前缺乏靶向卵巢颗粒细胞转基因小鼠模型，严重制约了POF的机制研究和有效药物的研发。本专利技术通过RNA-seq高通量测序发现miR-3061在POF小鼠卵巢颗粒细胞内显著降低表达。体外实验也证实，过表达miR-3061会显著促进原代小鼠卵巢颗粒细胞的老化和凋亡。CRISPR/Cas9技术：一种基因编辑技术，通过对靶向基因进行特定DNA修饰，以获取相应的结果的技术。Mir3061基因：microRNA3061基因，microRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与生物体转录后基因表达调控。Rosa26：基因Gt(ROSA)26Sor的缩写为Rosa26。本专利技术进一步研究发现miR-3061与卵巢颗粒细胞存在关联，利用CRISPR/Cas9技术构建Rosa26定点miR-3061基因Cre-loxP条件性敲入小鼠模型，成功构建C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sorem(EF1a-Mir3061)1Smoc小鼠，对研究卵巢早衰提供了实验动物模型，从而进一步用于筛选制备检测/治疗卵巢疾病药物有重要的意义·。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计利用CRISPR/Cas9技术构建Rosa26定点miR-3061基因Cre-loxP条件性敲入小鼠模型及其应用。为POF发病机制的研究和药物设计及药效评价提供有效的实验动物数据。本专利技术方法所述构建得到的模型的小鼠基因为Rosa26LSL/+，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本专利技术提供了利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，该方法包括如下步骤：A、确定小鼠5号和3号染色体上的Rosa26基因所在位点为site1如SEQIDNO：1所示，序列表2，设计gRNA1的设计识别位点如SEQIDNO：2所示，序列表3；B、构建表达gRNA1的表达载体；C、将步骤B得到的表达gRNA1表达载体，以及含Cas9基因的表达载体共转染C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；经长片段PCR鉴定，共获得正确同源重组的F0代小鼠；D、F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。进一步地，利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，步骤C中PCR鉴定的检测引物序列为，序列表4：P1:atggcgtgttttggttggcgtaag(SEQIDNO：3)P2:tttttgggggtgatggtggtc(SEQIDNO：4)。步骤C中PCR鉴定的检测引物序列为，P1为序列表4，P2为序列表5。更具体的构建方法，包括下列步骤：(1)通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和gRNA；通过In-Fusioncloning的方法构建同源重组载体(donorvector)，该载体包含3.3kb5’同源臂、(倒置polyA-EGFP、loxp-loxp2272-EF1a-promoter-loxp-loxp2272)、Mir3061-polyA、3.3kb3’同源臂；(2)将Cas9mRNA、gRNA和donorvector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；经长片段PCR鉴定，共获得3只正确同源重组的F0代小鼠；(3)F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得5只阳性F1代小鼠。本专利技术方法中，Mir3061基因Rosa26位点条件性过表达杂合子小鼠无明显异常。倒置的loxp-loxp2272-EF1a-promoter-loxp-loxp2272表达框的存在阻止了下游目的基因Mir3061的转录。目的基因Mir3061的表达部位及效率，取决于Cre表达的组织类型和效率。Mir3061基因Rosa26位点条件性过表达小鼠与Cre小鼠交配后，在其后代双阳性小鼠中，Cre表达的组织和细胞类型，倒置的loxp-loxp2272-EF1a-promoter-loxp-loxp2272表达框将被转正，目的基因Mir3061在EF1a启动子的驱动下，实现高表达。过表达目的基因名称(MGI号)：Mir3061(4834233)目的基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary？db＝core；g＝ENSMUSG00000092870；r＝11:52126746-52126836；t＝ENSMUST00000175129插入位点基因名称(Ensembl)：Gt(ROSA)26Sor(ENSMUSG00000086429)，简称：Rosa26插入位点目的基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary？db＝core；g＝ENSMUSG00000086429；r＝6:113067428-113077333插入位点染色体位置(Ensembl)：Chromosome6:113,076,031本专利技术通过上述构建方法获得的小鼠基因型为Rosa26LSL/+。本专利技术首次提供了Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型及其构建方法，未见任何国内外文献报道。本专利技术方法构建的小鼠模型为生殖发育遗传学和筛选制备检测/治疗卵巢疾病药物以及相关药物筛选提供有效的实验动物模型，具有良好的医学临床应用前景，在制备检测/治疗卵巢疾病药物中有很大的应用价值，有较大的社会效益。附图说明图1：体外转录Cas9、gRNA电泳结果(实施例1，以下同)1:Mir3061guideRNA1；M：DL2000maker(Takara)a:pXT7-Cas9质粒；b:线性化pXT7-Cas9质粒；c:Cas9mRNA；d:1kbDNAmaker(Thermo)图2：打靶载体质粒图谱图3：打靶载体酶切鉴定电泳图1:B公路酶切鉴定结果，理论条带大小为2.6kb、5.5kb、8.0kb；M：1kbDNAladder。图4：同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图6、11、14为阳性F0小鼠，wt为野生型对照；M为1kbDNAmarker,marker左侧为5’同源臂鉴定结果，marker右侧为3’同源臂鉴定结果。图5：F1代小鼠5’同源臂和3’同源臂PCR鉴定电泳图F1代小鼠5’同源臂(Marker左侧)和3’同源臂(Marker右侧)PCR鉴定电泳图(数字：F1代小鼠编号；wt：野生型对照；M：1kbDNAladder)图6：F1代小鼠5’同源臂PCR鉴定测序比对结果1#测序反应比对结果图7：2#测序反应比对结果：图8：3#测序反应比对结果图9：4#测序反应比对结果图10通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和gRNA；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型。

【技术特征摘要】
1.Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型。2.根据权利要求1所述Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建得到的模型的小鼠基因为Rosa26LSL/+，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：A、确定小鼠5号和3号染色体上的Rosa26基因所在位点为site1如SEQIDNO：1所示，序列表2，设计gRNA1的设计识别位点如SEQIDNO：2所示，序列表3；Site1位点1ActgtgaatataaaaatgatagcttttcctgaggcagggtctcactatgtatctctgcctgatctgcaacaagatatgtagactaaagttctgcctgcttttgtctcctgaatactaaggttaaaatgtagtaatacttttggaacttgcaggtcagattcttttataggggacacactaagggagcttgggtgatagttggtaaaatgtgtttcaagtgatgaaaacttgaattattatcaccgcaacctactttttaaaaaaaaaagccaggcctgttagagcatgcttaagggatccctaggacttgctgagcacacaagagtagttacttggcaggctccSEQIDNO：1gRNA1GGGGACACACTAAGGGAGCTTGGSEQIDNO：2B、构建表达gRNA1的表达载体；C、将步骤B得到的表达gRNA1表达载体，以及含Cas9基因的表达载体共转染C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；经长片段PCR鉴定，共获得正确同源重组的F0代小鼠；D、F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。4.根据权利要求3所述Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤C中PCR鉴定的检测引物序列为，P1为序列表4，P2为序列表5：P1:atggcgtgttttggttggcgtaagSEQIDNO：3P2:tttttgggggtgatggtggtcSEQIDNO：4；Cas9和gRNA体外转录结果见下表1表1gRNA序列(5’-3’)gRNA1GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG；(2)同源重组质粒构建同源重组质粒图谱表2：各元件名称详解同源重组质粒酶切鉴定打靶载体酶切鉴定电泳图：1:B公路酶切鉴定结果，理论条带大小为2.6kb、5.5kb、8.0kb；M：1kbDNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘特，郑锦，陈川，郁志华，林佳佳，
申请(专利权)人：上海市中医老年医学研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31