用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法技术

本发明专利技术涉及基因工程中的基因编辑技术领域，具体涉及一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法。该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。本发明专利技术围绕CRISPR/Cas9技术在模式动物果蝇中的应用，提供了一种优化的Cas9的表达载体，显著地提高了基因编辑效率，也为其在其他领域的应用奠定了基础。

Cas9 transcription template DNA, plasmid DNA and in vitro transcription method for Drosophila CRISPR gene

The invention relates to the field of gene editing technology in genetic engineering, in particular to cas9 transcription template DNA and plasmid DNA for Drosophila CRISPR transgene and in vitro transcription method. The cas9 transcription template DNA has a base sequence as shown in SEQ ID NO:1. The invention provides an optimized Cas9 expression vector around the application of CRISPR/Cas9 technology in model animal Drosophila melanogaster, which significantly improves the efficiency of gene editing and lays a foundation for its application in other fields.

【技术实现步骤摘要】
用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法
本专利技术涉及基因工程中的基因编辑
，更具体地，涉及一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA与应用和体外转录方法。
技术介绍
传统的转基因技术主要是利用转座的原理，将外源DNA片段随机地整合到生物基因组上，很难做到精确地修改(即基因编辑)。继转基因技术之后出现了ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术，都基于核酸内切酶精确地靶向基因组DNA的原理，均能实现对基因组的精确修饰，成为目前主流的三大基因编辑技术。相对于ZFN和TALEN技术，CRISPR/Cas9技术的操作更简单、成本更低廉、效率更高，成为目前基因编辑的首选。CRISPR/Cas9基因编辑技术，是由细菌中行使免疫功能的CRISPR/Cas9系统改造而来。主要通过一段引导RNA(singleguideRNA，sgRNA)，将Cas9核酸内切酶引导到目标片段，并进行切割，再利用生物体自身的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)修复机制实现对基因组的修饰和编辑，包括小片段插入删除(indel)、较大片段DNA删除(deletion)、特定位置添加序列标签、单碱基替换等等。利用CRISPR/Cas9技术，可以构建目标基因功能缺失(KO)突变体、用于检测目的基因表达的工具品系、用于精确分析单个氨基酸功能的单碱基修饰品系等，大大加快了生物学研究的进度。除了应用于科研领域，CRISPR/Cas9基因编辑技术还被应用于细胞治疗、牲畜改良、作物改良等与人们生活息息相关的健康、环境和能源领域，具有广阔的应用前景。目前，影响CRISPR/Cas9技术效率的主要因素之一是Cas9的活性。因此，亟需一种方法能够提高Cas9的活性，从而提高基因编辑的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种Cas9的表达载体及体外转录方法，具有高的基因编辑效率。为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA，该cas9转录模板DNA具有如SEQIDNO：1所示的碱基序列。所述cas9转录模板DNA为密码子优化后的cas9转录模板DNA。具体是将人源cas9密码子优化为果蝇适应的密码子，提高cas9-mRNA在果蝇体内的翻译效率，从而提高cas9蛋白表达水平。优化所采用的工具网站：http://www.jcat.de/。将优化所得序列进行基因合成，最终得到果蝇密码子优化后的cas9CDS转录模板DNA。本专利技术的第二方面提供一种用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，该质粒DNA包括以下元件：cas9转录基因，所述cas9转录基因具有如SEQIDNO：1所示的碱基序列；第一40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因起始密码子ATG之后，cas9转录基因之前；第二40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因中止密码子之前，cas9转录基因之后；Kozak序列，所述Kozak序列位于所述起始密码子ATG之前；T7启动子；sv40-3UTR，所述sv40-3UTR位于所述终止密码子之后；限制性酶切位点，所述限制性酶切位点位于所述sv40-3UTR之后。本专利技术中，所述“之前”是指位于目标序列的上游5’端，所述“之后”是指位于目标序列的下游3’端。该质粒DNA各元件示意图如图1所示，质粒DNA的完整图谱如图2所示。根据本专利技术，优选地，所述限制性酶切位点为XbaI酶切位点。根据本专利技术，将sv40-nls入核信号(其氨基酸序列为：Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，SEQIDNO：3)加到cas9CDS的两侧(ATG后面和终止密码子前面)。两端同时放入入核信号，增加了cas9蛋白对细胞核的通过性，可以更加有效地进行基因组基因编辑。在起始密码子ATG的前面添加Kozak序列“GCCACC”，增加cas9在果蝇体内的表达水平。T7启动子对cas9DNA序列进行体外转录，具有更高的转录效率，可以在相同条件下比sp6等其他的启动子得到产量更高的cas9mRNA。终止密码子后面添加sv403UTR作为cas9mRNA的3UTR，比传统加polyA的方法节省了转录合成mRNA成本和时间，同时，sv40-3UTR作为果蝇基因表达常用的3UTR，可以增加cas9mRNA在果蝇体内的稳定性，对表达cas9蛋白起到促进作用。通过对cas9转录模板DNA序列的各方面的优化，提高了cas9-mRNA在果蝇体内内源表达的效率，从而提高了对果蝇基因组基因编辑的效率。根据本专利技术，采用具有上述元件的质粒DNA即可实现提高cas9-mRNA在果蝇体内内源表达的效率，很显然地，该质粒DNA可以含有其他不影响上述元件功能或能够辅助上述元件的其他DNA序列，例如，位于T7启动子和Kozak序列之间的片段，此类DNA序列的总长度不超过100nt。根据本专利技术一种优选实施方式，所述cas9转录模板DNA仅包括上述功能元件，不含有其他功能元件。最优选地，所述cas9转录模板DNA具有如SEQIDNO：2所示的碱基序列。本专利技术的第三方面提供上述cas9转录模板DNA和上述质粒DNA中至少一种的应用。所述应用例如作为基因编辑工具。具体地，本专利技术还提供一种cas9mRNA体外转录方法，该方法包括：(1)将上述质粒DNA进行扩增和酶切线性化，并将得到的线性化模板进行纯化；(2)将步骤(1)得到的纯化后的模板进行体外转录和纯化。该方法中，上述扩增和酶切线性化均可采用常规分子生物学方法。步骤(1)中，所述纯化的步骤优选包括：采用蛋白酶K加SDS将酶切体系的内切酶去除，然后通过乙醇沉淀。该纯化方法简便、得率高，纯度也很高。根据本专利技术，所述体外转录也可采用常规分子生物学方法，以及采用常规商购体外转录试剂。优选地，所述体外转录中GTP的用量为20-50mM时，能够大大提高转录的效率，提高cas9mRNA的产量。根据本专利技术，该方法还包括：对cas9mRNA的浓度进行检测，所述检测方法为电泳比对法。即，即将合成好的mRNA稀释不等的倍数，与DNA标准一起电泳，根据条带的亮度确定cas9mRNA的实际浓度。本专利技术围绕CRISPR/Cas9技术在模式动物果蝇中的应用，提供了一种优化的Cas9的表达载体，显著地提高了基因编辑效率。也为其在其他领域的应用奠定了基础。此外，本专利技术还提供cas9mRNA体外转录方法，该方法具有以下优点：(1)采用蛋白酶K加SDS的纯化方法，简便、得率高，纯度也很高。(2)增加了转录体系中GTP的用量，大大提高转录的效率，提高cas9mRNA的产量。(3)传统的方法需要对转录完成的cas9mRNA进行polyA加尾，由于已经提前引入了sv40-3UTR，所以不需要加尾，简化了实验流程。(4)现有技术中采用nanodrop检测核酸浓度的方法，由于转录完成的体系中有大量dNTP的干扰，导致测量浓度比实际浓度过高，如果按照nanodrop测量浓度来配制果蝇注射样品，会导致样品中cas9mRNA的量过少，大大影响转基因效率；本专利技术采用电泳比对法来测定Cas9mRNA的浓度，该方法确定的浓度更准确，进而提高转基因效率。本专利技术结合了对Cas9的转录模板DNA、表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA，其特征在于，该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA，其特征在于，该cas9转录模板DNA具有如SEQIDNO：1所示的碱基序列。2.一种用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，其特征在于，该质粒DNA包括以下元件：cas9转录基因，所述cas9转录基因具有如SEQIDNO：1所示的碱基序列；第一40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因起始密码子ATG之后，cas9转录基因之前；第二40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因中止密码子之前，cas9转录基因之后；Kozak序列，所述Kozak序列位于所述起始密码子ATG之前；T7启动子；sv40-3UTR，所述sv40-3UTR位于所述终止密码子之后；限制性酶切位点，所述限制性酶切位点位于所述sv40-3UTR之后。3.根据权利要求2所述的用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，其中，所述限制性酶切位点为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张力，李政，
申请(专利权)人：张力，李政，
类型：发明
国别省市：北京,11