一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法技术

本发明专利技术公开了一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，采用温和的变性方法溶解包涵体蛋白，保护包涵体蛋白中原有的二级结构不被破坏将大大有利于包涵体蛋白的复性；该方法集合了稀释及透析进行蛋白复性的方法，第一次稀释降低变性剂浓度，促进蛋白复性，第二次稀释降低添加剂浓度，使蛋白更容易适应基础缓冲液的环境，最后进行透析去除各种添加剂，可以得到复性效率高，浓度高的复性后蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法。
技术介绍
随着基因工程应用产业的快速发展，使得通过体外表达并获得具有生物活性的蛋白，并应用于大规模工厂化成为可能。大肠杆菌因其易于操作、遗传背景清楚、生产成本低和表达水平高而常被用作宿主细胞应用于重组蛋白的表达。蛋白在原核宿主细胞中的高效表达，经常聚集形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，即包涵体。包涵体是无规则伸展肽链的聚集体，没有生物活性，需要对包涵体蛋白进行溶解然后复性。迄今为止，还没有普遍适用于所有重组蛋白质的复性方案，包涵体蛋白质的复性已成为制约重组蛋白质生产的关键因素之一。通常，将包涵体蛋白复性变为活性蛋白需要做如下三步处理：第一，收获并洗涤包涵体；第二，溶解包涵体，得到变性蛋白；第三，复性，逐步去除变性剂，使蛋白恢复正确折叠。前两步收率相对较高，第三步收率较低，不正确的折叠蛋白构型是主要的限制因素。目前包涵体复性主要有稀释复性法和透析、超滤或电渗透去除变性剂两种方式；其中稀释复性法和透析复性法是最为简单的，被广泛采用于实验室蛋白功能与结构研究，但在复性过程中，易造成蛋白的降解或重新聚集，使得蛋白回收率较低。本专利技术针对现有技术的缺陷，提供一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，该方法集合了稀释及透析进行蛋白复性的方法，在保证蛋白生物活性不受损失的基础上，使蛋白更易通过透析去除各种添加剂，最终得到复性效率高，浓度高的复性后蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，可以获得复性效率高，浓度高的复性后蛋白。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，具体包括以下步骤：1)使用变性剂对待用包涵体蛋白进行溶解，获得溶解度为8-20mg/ml的包涵体蛋白；2)在4℃下，将步骤1)溶解后的包涵体蛋白缓慢滴加到复性缓冲液中将其稀释8倍，边加边搅拌，滴加完毕后，在4℃环境下静置12h；3)将步骤2)得到的溶液采用离心机以16000rpm离心10min，收集蛋白上清液，在4℃下，使用基础缓冲液稀释蛋白上清液；所述的基础缓冲液和蛋白上清液的体积比为1:1；4)将步骤3)稀释后的的蛋白上清液使用离心机以16000rpm离心10min，收集上清液，在4℃下，将收集的上清液透析到基础缓冲液中，所述的上清液与基础缓冲液的体积比为1:50；边透析边搅拌，待透析8h后更换一次基础缓冲液；5)将步骤4)透析后的蛋白缓冲液使用离心机以16000rpm离心30min，收集上清液即为复性后蛋白。进一步，所述的变性剂组成为1L溶液中含有：3mol盐酸胍，0.2mmolDTT,50mmolTris-HCl,150mmolNaCl,0.7molL-精氨酸,15mmolEDTA；所述的变性剂pH为8.5。进一步，所述复性缓冲液是1L溶液中含有50mmolTris-HCl,150mmolNaCl,1molL-精氨酸,0.2mmolDTT,10％甘油,0.1％PEG3500的溶液，复性缓冲液pH为9.0。进一步，所述基础缓冲液是1L溶液中含有50mmolTris-HCl,150mmolNaCl,10％甘油,基础缓冲液pH为8.0。进一步，步骤4)所述的透析用的透析膜为改性壳聚糖-聚甲基丙烯酸酯复合膜。进一步，所述的改性壳聚糖-聚甲基丙烯酸酯复合膜的制备方法为：第一步：改性壳聚糖的制备将1g壳聚糖溶于100ml质量分数为60％的乙酸溶液中，称取0.1-0.15g无水氯化锌加入其中，加热溶解并升温至80℃，继续搅拌20-30min，接着用10mol/L的氢氧化钠水溶液调节反应液的pH为6.5-7.5,冷却到室温，经抽滤、水洗、乙醇醇洗后，抽干，在105℃下干燥即得多孔Zn交联的改性壳聚糖，备用；第二步、复合膜的制备将第一步制备的0.5g改性壳聚糖溶于200mlDMF中，加入20g聚甲基丙烯酸酯和0.2g聚乙二醇，待溶液混合均匀后，放入摇床震荡2天，摇床的温度控制在40-43℃，转速为110-120r/min，震荡完毕后，在真空度为0.05MPa下进行真空脱泡，接着均匀流延在光滑的玻璃板上，刮膜，在室温下放置4-6h，放入温度为20-25℃的去离子水中凝胶成膜，去离子水中浸泡15-20h，取出放入鼓风干燥箱在60℃下进行干燥8-10h，即得到改性壳聚糖-聚甲基丙烯酸酯复合膜。进一步，所述的聚甲基丙烯酸酯为聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯中的一种。进一步，所述的聚乙二醇的分子量为1000。本专利技术的有益效果：(1)包涵体一般认为是蛋白错误折叠所形成的无活性的、不可溶的蛋白形式，只溶于强变性剂，如8M的尿素或6M的盐酸胍；通过将包涵体蛋白溶于变性缓冲液，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展而可溶。变性的蛋白通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的伸展状态恢复到正确的高级结构。而最近研究发现包涵体蛋白具有一定的二级结构，如果在溶解包涵体的过程中能够保留原有的二级结构可以启动蛋白的复性阶段，大大提高蛋白的复性效率。由于强变性剂使多肽完全伸展，破坏了原有的二级结构，复性过程中蛋白聚集沉淀，导致复性蛋白浓度低，效率低，而且需要大体积的缓冲液，长时间的复性过程等。因此，采用温和的变性方法溶解包涵体蛋白，保护包涵体蛋白中原有的二级结构不被破坏将大大有利于包涵体蛋白的复性；该方法集合了稀释及透析进行蛋白复性的方法，第一次稀释降低变性剂浓度，促进蛋白复性，第二次稀释降低添加剂浓度，使蛋白更容易适应基础缓冲液的环境，最后进行透析去除各种添加剂，可以得到复性效率高，浓度高的复性后蛋白；(2)采用浸没沉淀相转化法制备以聚甲基丙烯酸酯为基体,改性壳聚糖为分散相的透析复合膜材料，将Zn2+络合到壳聚糖中，增加了壳聚糖网络的密度,与聚甲基丙烯酸酯之间物理交织更加紧密,分子链之间的距离更近,易于在之间形成氢键,相互作用力增大，并且半刚性的结构使其倾向于紧密而有序的排列,有序度较高的分子链在凝固时就易形成晶体,复合膜便有了较高的结晶度,制得的复合膜在300℃前没有出现明显的失重现象，具有良好的热稳定性，稳定的耐热性能是透析过程顺利进行的保证；由于改性壳聚糖分子链上带有多个轻基,亲水性能好,可弥补聚甲基丙烯酸酯材料亲水性差的缺点,亲水性的增加降低了复合膜对蛋白质的吸附,故而增加了复合膜的抗污染能力，结合聚乙烯醇有助于复合膜孔隙率和平均孔径的增加,复合膜指状孔孔径增大,膜表面膜孔分布密集，其协同作用提高了透析膜的渗透通量，渗透通量可达56.6ml/(m2*h*mmHg)，另外，多孔Zn交联的改性壳聚糖用于复合透析膜中，可提升复合透析膜的抗菌能力和生物相容性，最重要的是可提高透析膜的杂质清除率；对于盐酸胍的一次清除率高达95.3％。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。下述实施例中，改性壳聚糖-聚甲基丙烯酸酯复合膜的制备方法为：第一步：改性壳聚糖的制备将1g壳聚糖溶于100ml质量分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1)使用变性剂对待用包涵体蛋白进行溶解，获得溶解度为8‑20mg/ml的包涵体蛋白；2)在4℃下，将步骤1)溶解后的包涵体蛋白缓慢滴加到复性缓冲液中将其稀释8倍，边加边搅拌，滴加完毕后，在4℃环境下静置12h；3)将步骤2)得到的溶液采用离心机以16000rpm离心10min，收集蛋白上清液，在4℃下，使用基础缓冲液稀释蛋白上清液；所述的基础缓冲液和蛋白上清液的体积比为1:1；4)将步骤3)稀释后的的蛋白上清液使用离心机以16000rpm离心10min，收集上清液，在4℃下，将收集的上清液透析到基础缓冲液中，所述的上清液与基础缓冲液的体积比为1:50；边透析边搅拌，待透析8h后更换一次基础缓冲液；5)将步骤4)透析后的蛋白缓冲液使用离心机以16000rpm离心30min，收集上清液即为复性后蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1)使用变性剂对待用包涵体蛋白进行溶解，获得溶解度为8-20mg/ml的包涵体蛋白；2)在4℃下，将步骤1)溶解后的包涵体蛋白缓慢滴加到复性缓冲液中将其稀释8倍，边加边搅拌，滴加完毕后，在4℃环境下静置12h；3)将步骤2)得到的溶液采用离心机以16000rpm离心10min，收集蛋白上清液，在4℃下，使用基础缓冲液稀释蛋白上清液；所述的基础缓冲液和蛋白上清液的体积比为1:1；4)将步骤3)稀释后的的蛋白上清液使用离心机以16000rpm离心10min，收集上清液，在4℃下，将收集的上清液透析到基础缓冲液中，所述的上清液与基础缓冲液的体积比为1:50；边透析边搅拌，待透析8h后更换一次基础缓冲液；5)将步骤4)透析后的蛋白缓冲液使用离心机以16000rpm离心30min，收集上清液即为复性后蛋白。2.根据权利要求1所述的一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，其特征在于：所述的变性剂组成为1L溶液中含有：3mol盐酸胍，0.2mmolDTT,50mmolTris-HCl,150mmolNaCl,0.7molL-精氨酸,15mmolEDTA；所述的变性剂pH为8.5。3.根据权利要求1所述的一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，其特征在于：所述复性缓冲液是1L溶液中含有50mmolTris-HCl,150mmolNaCl,1molL-精氨酸,0.2mmolDTT,10％甘油,0.1％PEG3500的溶液，复性缓冲液pH为9.0。4.根据权利要求1所述的一种包涵体蛋白稀释透析复性的方法，其特征在于：所述基础缓冲液是1L溶液中含有50...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，张伦，
申请(专利权)人：安徽环球基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34