一种神经干细胞制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种神经干细胞制剂及其制备方法，所述神经干细胞制剂包括间充质干细胞、海藻糖溶液、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，所述间充干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞为P3代‑5代的间充质干细胞；所述充质干细胞用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后加入培养基机械吹打为单细胞悬液，在CO2、37℃下经过体外培养，筛选出神经干细胞球。本发明专利技术在干细胞制剂中含有海藻糖组分，海藻糖能够保护细胞膜受损，维持细胞内外的渗透压，从而保证了细胞的活性，在制备间充质干细胞制剂的过程中，添加表皮生长因子、成纤维细胞生长因子，能够促进间充质干细胞分化为神经细胞，达到治疗或修复神经损伤的目的。

A preparation of neural stem cells and its preparation method

The invention discloses a preparation of neural stem cells and a preparation method thereof. The preparation of neural stem cells includes mesenchymal stem cells, trehalose solution, epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor. The mesenchymal stem cells are umbilical cord mesenchymal stem cells, placental mesenchymal stem cells or adipose mesenchymal stem cells of the P3 generation. Five generations of mesenchymal stem cells; the mesenchymal stem cells were digested with digestive juice and then added to the culture medium to stop digestion, centrifuged and then added to the culture medium to blow the single cell suspension mechanically, and cultured in vitro at CO 2 and 37 ~C to screen out the neural stem cell spheres. The invention contains trehalose component in the stem cell preparation, trehalose can protect the damaged cell membrane, maintain the osmotic pressure inside and outside the cell, thus ensuring the cell activity. In the process of preparing the mesenchymal stem cell preparation, the addition of epidermal growth factor and fibroblast growth factor can promote the mesenchymal stem cell component. To transform into nerve cells, to achieve the purpose of treating or repairing nerve injury.

【技术实现步骤摘要】
一种神经干细胞制剂及其制备方法
本专利技术涉及生物制品
，具体为一种神经干细胞制剂及其制备方法。
技术介绍
神经损伤是一种临床多发病，多见于神经内科，若临床治疗方法不当常会引起神经功能受损，引发不可逆的损害。对于神经损伤的临床治疗方法众多，本专利技术一种通过间充质干细胞治疗患者神经损伤的方法，疗效显著。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的特殊细胞，根据其来源不同可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。成体干细胞的移植已经在神经系统、造血系统等许多人类疾病的治疗中发挥了重要的作用，成体干细胞具有以下优势：获取相对容易；源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂；成体干细胞致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少；成体干细胞还具有多向分化潜能。干细胞移植主要集中在：胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。干细胞移植修复神经损伤的目的在于：①可以诱导分化为神经元或神经胶质细胞，替代死去的细胞，进而恢复脊髓功能；②可以在体内表达多种神经营养因子，改善细胞外微环境，促进轴突再生，阻止细胞凋亡；③提供新的神经细胞作为再神经化的源头及上下级神经元信号传递的中转站；④填充于损伤区从而抑制胶质细胞的过度增生。干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，可发育为某一器官或组织的特性为其在中枢神经系统疾病的保护与修复中的研究及应用奠定了基础。间充质干细胞是细胞生物学中干细胞家族中的重要组成成员，其来源于发育早期的胚胎的中胚层和外胚层，其最初在人群的骨髓中发现，主要临床特征为具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床使用越来越引起人群的重视。在体内或体外一定的诱导条件下可分化为脂肪、肌肉、心肌、肌腱、韧带、肝、骨、软骨、内皮等多种人体组织细胞，采用连续传代培养以及冷冻保存的方法可依然具有多向分化的潜能，临床常作为理想组织器官损伤修复，尤其是神经损伤，临床研究证实，采用间充质干细胞还可以治疗多种血液系统疾病、心血管疾病。神经损伤包括脑外伤、脑血管硬化、脑溢血、脑血栓、后遗症、脑炎与脑膜炎后遗症、脱髓鞘疾病等脑血管病后遗症，采用间充质干细胞治疗神经损伤取得了良好的临床效果，应加强临床推广。海藻糖是一种由葡萄糖的1,1-糖苷键产生的二糖，由于海藻糖给予甜味并且具有高度保水能力，因而广泛应用于多种食品和化妆品的生产中，此外，由于海藻糖具有稳定细胞膜并且抑制细胞损伤的功能，因而在临床上将其作为器官保护液体的活性组分，用于器官移植。既往研究显示，在发育脑和成年脑内，神经元和星形胶质细胞均可表达表皮生长因子，且在发育较晚期，表皮生长因子参与神经前体细胞增殖分化及细胞的生存和迁移，同时其作为具有神经营养活性的因子，在神经损伤后可以保护相应的背根神经节感觉神经元，表皮生长因子还是一种脑肠肽神经递质，碱性成纤维生长因子广泛存在于中枢及外周神经系统中，对神经元有维持生存和促进生长及受损神经元的修复与再生作用，且碱性成纤维生长因子能够与其它生长因子协同共同修复神经损伤，表皮生长因子是有丝分裂的促进因子，对细胞分裂具有促进作用，可诱导神经干细胞向星形胶质细胞分化，并促进轴突的生长和维持其存活；碱性成纤维细胞生长因子能维持由表皮生长因子激发的神经干细胞的存活及增殖，同样对神经干细胞具有定向诱导分化作用，并能维持神经元和星形胶质细胞的存活，具有丝裂原样作用，表皮生长因子和碱性成纤维生长因子具有协同作用，促进神经干细胞的分化。
技术实现思路
本专利技术提供一种神经干细胞制剂及其制备方法，可以有效解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种神经干细胞制剂，包括间充质干细胞、海藻糖溶液、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，所述间充干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞为P3代-5代的间充质干细胞；所述充质干细胞用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后加入培养基机械吹打为单细胞悬液，在CO2、37℃下经过体外培养，筛选出神经干细胞球，即得到神经干细胞制剂。进一步的，所述的消化液可以采用的胰蛋白酶+的EDTA、胰蛋白酶或胶原酶中的一种；其中胰蛋白酶用量为0.1wt％-0.5wt％、胶原酶150u/m1-250u/m1，EDTA的用量为0.005-0.02wt％；优选消化液为胰蛋白酶0.25％或0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA。进一步的，所述的中止消化的培养基为DMEM/F12+10-20V％胎牛血清、DMEM+10-20V％胎牛血清中的一种，培养基的用量为25-70ml；优选采用DMEM/F12+10-20V％胎牛血清。进一步的，所述海藻糖溶液的浓度为50-90mg/mL。进一步的，干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为106-109个细胞/mL。进一步的，干细胞制剂中表皮生长因子的浓度为10-15ng/mL。进一步的，干细胞制剂中碱性成纤维生长因子的浓度为15-20ng/mL。一种神经干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：1)、对间充质干细胞进行分离纯化，传代培养，取P3代-P5代间充质干细胞；2)、对P3代-P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；3)、收集并纯化间充质干细胞，重悬于海藻糖溶液内，海藻糖溶液浓度为50-90mg/mL，海藻糖溶液中含间充质干细胞106-109个/mL，添加表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，即可得到干细胞制剂；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。进一步的，步骤2)所述各项指标合格是指：病毒和无菌检测均为阴性，免疫表型的阳性表达率大于95％，阴性表率达小于2％，细胞活率达到95％以上，具有分化功能。进一步的，步骤3)中海藻糖溶液浓度为60-80mg/mL，干细胞制剂中表皮生长因子的浓度为10-15ng/mL，干细胞制剂中碱性成纤维生长因子的浓度为15-20ng/mL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：1)、本专利技术在制备间充质干细胞制剂的过程中，添加表皮生长因子、成纤维细胞生长因子，能够促进间充质干细胞分化为神经细胞，达到治疗或修复神经损伤的目的。2)、本专利技术的干细胞制剂中含有海藻糖组分，海藻糖能够保护细胞膜受损，维持细胞内外的渗透压，从而保证了细胞的活性。3)、本专利技术的间充质干细胞制剂包含脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞或胎盘间充质干细胞，间充质干细胞的来源比较广泛，可扩增复制若干代，细胞数量及活性能够满足患者的治疗剂量，同时间充质干细胞还可应用于构建间充质干细胞库。4)、本研究应用无血清培养液培养和扩增MSCs，这样可以维持其低分化状态，并保持多向分化能力，避免增殖过程中的成熟分化，细胞周期检测显示超过90％的细胞处于静止期，表明获得的细胞大多处于早期的未分化阶段，提示本研究获取的MSCs可以在体外大量扩增和长期培养，并且可以长时间保持其未分化状态。5)、本专利技术使用的间充质干细胞即可来源于新生儿出生后的胎盘或脐带，也可来源于成年人的脂肪组织，组织来源广泛，可应用较广泛，对供着没有任何损伤，可作为间充质干细胞的来源。6)、本专利技术的间充质干细胞制剂没有细胞数量上的限制，可多次扩增细胞和使用。具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种神经干细胞制剂，其特征在于，包括间充质干细胞、海藻糖溶液、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，所述间充干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞为P3代‑5代的间充质干细胞；所述充质干细胞用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后加入培养基机械吹打为单细胞悬液，在CO2、37℃下经过体外培养，筛选出神经干细胞球，即得到神经干细胞制剂。

【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞制剂，其特征在于，包括间充质干细胞、海藻糖溶液、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，所述间充干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞为P3代-5代的间充质干细胞；所述充质干细胞用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后加入培养基机械吹打为单细胞悬液，在CO2、37℃下经过体外培养，筛选出神经干细胞球，即得到神经干细胞制剂。2.根据权利要求1所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于，所述的消化液可以采用的胰蛋白酶+的EDTA、胰蛋白酶或胶原酶中的一种；其中胰蛋白酶用量为0.1wt％-0.5wt％、胶原酶150u/m1-250u/m1，EDTA的用量为0.005-0.02wt％；优选消化液为胰蛋白酶0.25％或0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA。3.根据权利要求1所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于，所述的中止消化的培养基为DMEM/F12+10-20V％胎牛血清、DMEM+10-20V％胎牛血清中的一种，培养基的用量为25-70ml；优选采用DMEM/F12+10-20V％胎牛血清。4.根据权利要求1所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于，所述海藻糖溶液的浓度为50-90mg/mL。5.根据权利要求1所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于，干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为106-109个细胞/mL。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王光辉，张敏娜，钟鸣，王慧云，王其宝，丁林，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37