一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，包括以下步骤：将胆固醇和卵磷脂溶解于溶剂，再除去溶剂得脂质体薄膜，加入人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体；将人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体和复方电解质注射液混合均匀得到人脐带间充质干细胞分泌因子注射液。本发明专利技术制得的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增加，有助于皮肤创面伤口的修复。

A preparation method of human umbilical cord mesenchymal stem cell secretion factor injection for repairing subcutaneous tissue after burn and scald surgery

The present invention relates to a preparation method of human umbilical cord mesenchymal stem cell secretion factor injection for repairing subcutaneous tissue after burn and scald operation. It includes the following steps: dissolving cholesterol and lecithin in solvent, removing solvent to obtain liposome film, adding human umbilical cord mesenchymal stem cell secretion factor base and putting it in shaking bed for hydration for 3 hours, waiting for the liposome film to fall off, and obtaining. Large-size liposomes were prepared and homogenized by ultrasound. Human umbilical cord mesenchymal stem cell secretory factor vesicle liposomes were prepared. Human umbilical cord mesenchymal stem cell secretory factor vesicle liposomes and compound electrolyte injection were mixed to obtain human umbilical cord mesenchymal stem cell secretory factor injection. The human umbilical cord mesenchymal stem cell secretion factor injection prepared by the invention stimulates and cultures human primary dermal fibroblasts, thereby increasing the expression of type I collagen fibers in human primary dermal fibroblasts and contributing to the repair of skin wounds.

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法
本专利技术涉及生物医药
，更具体的说，它涉及一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法。
技术介绍
创面愈合是一个错综复杂的生物学过程，该过程通过细胞因子的高度协调介导细胞与细胞间或细胞与基质间的相互作用来修复受损组织。细胞因子的协调不良或功能障碍均可导致创面愈合“失控”，在临床上表现为创面难愈。难愈性创面常见于深度烧伤等疾病。造成创面难愈的主要原因可分为两大类：一类是由病菌感染引起的创面难愈。这类创面难愈通常伴随免疫细胞的异常激活。由于树突状细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞的持续激活，释放大量炎性因子、活性氧簇和蛋白水解酶，使创面局部处于长期过度的炎症反应阶段，从而导致肉芽组织和表皮组织长期无法形成。另一类是由局部缺血缺氧导致的创面难愈。创面局部血供不足引起营养成分及氧气供给的减少，造成胶原蛋白无法有效合成，同时基质金属蛋白酶的异常激活进一步导致大量细胞生长因子的降解，影响了创面局部成纤维细胞、表皮细胞和角质细胞的增殖和迁移能力，导致创面长期不愈合。现阶段难愈性创面的治疗原则首先是局部治疗服从全身治疗；其次创面的外科处理是局部治疗的前提和基础，如局部清创和抗感染等；最后采用某些措施和方法来促进难愈性创面愈合。近年来促进难愈性创面愈合的方法很多，经典的方法主要包括新型敷料类、基因工程药物(生长因子)类、传统医药类以及组织工程类。存在的主要问题是抗感染差、血管化延迟、制备技术复杂、生产周期长，价格昂贵以及组织工程皮肤存在生理缺陷等。干细胞疗法作为新型的治疗方式，其应用已涉及生长发育、创面愈合和组织工程等多个方面，其可能的作用机制如下：a.分化作用：干细胞作为新兴的种子细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，移植干细胞能自我更新并可分化成多种细胞，对组织进行修复；b.旁分泌作用：干细胞能够分泌大量细胞因子，以间充质干细胞为例，其分泌因子在功能上主要可分为免疫调节、抗细胞凋亡、血管发生、支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、抗瘢痕六大类。它们通过自分泌或旁分泌的方式，改善机体局部微环境，促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分化，挽救濒临凋亡的细胞，从而达到修复组织的目的。随着对干细胞研究的不断深入，研究者发现移植干细胞分化成组织细胞的几率很低且移植后存活时间很短。由于移植到患者体内的干细胞存活时间短暂的问题影响了其旁分泌作用的发挥。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增加，有助于皮肤创面伤口的修复。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于溶剂，再除去溶剂得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体；将重量比为1：2的人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体和复方电解质注射液混合均匀得到人脐带间充质干细胞分泌因子注射液。进一步，所述溶剂为氯仿。进一步，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块；所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人脐带间充质干细胞悬液；所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代人脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人脐带间充质干细胞；所述人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待Pe代人脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得人脐带间充质干细胞分泌因子；其中，e＝3、4、5、6、7、8、9、10。进一步，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代人脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。进一步，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。进一步，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代人脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代人脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代人脐带间充质干细胞悬液，将Pm代人脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养得Pm+1代人脐带间充质干细胞。进一步，所述无血清培养基为HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。进一步，所述人脐带间充质干细胞悬液的浓度为1×107个/mL。进一步，所述细胞培养瓶为T-175细胞培养瓶。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：第一、本专利技术制得的干细胞分泌因子注射液刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增加，有助本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于溶剂，再除去溶剂得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体；将重量比为1：2的人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体和复方电解质注射液混合均匀得到人脐带间充质干细胞分泌因子注射液。

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于溶剂，再除去溶剂得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体；将重量比为1：2的人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体和复方电解质注射液混合均匀得到人脐带间充质干细胞分泌因子注射液。2.根据权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，所述溶剂为氯仿。3.根据权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块；所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人脐带间充质干细胞悬液；所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代人脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人脐带间充质干细胞；所述人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待Pe代人脐带间充质干细胞达80-9...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵进军，谷广其，杨桂花，赵宇飞，李张鹏，
申请(专利权)人：和携科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11