一种基于液质联用定量多种肠道菌群有机酸的方法技术

本申请公开一种基于液质联用对多种肠道菌群有机酸进行定量的方法，所述方法包括：样品的制备，将所述样品进行预处理，然后用衍生化试剂进行衍生化；空白样品的制备；液质联用检测所述样品和所述空白样品；样品的定量分析。本申请还提供无放射性6个碳13稳定同位素标记3‑硝基苯肼或2‑硝基苯肼作为内标在检测肠道菌群有机酸中的用途。本申请的法基于高灵敏度的三重四级杆质谱仪；无放射性的6个碳13稳定同位素标记

【技术实现步骤摘要】
一种基于液质联用定量多种肠道菌群有机酸的方法
本申请涉及分析化学领域，尤其但不限于涉及一种基于效液相色谱/三重四级杆质谱定量肠道菌群有机酸的方法。
技术介绍
有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸是羧酸，它是一类参与生物体生命活动的重要物质，如参与三羧酸循环，维持机体供能等；许多疾病的发生发展都与有机酸代谢失调有关，如心血管疾病、阿尔茨海默病、糖尿病等；而短链脂肪酸是肠道菌群发酵多糖产生的主要产物，具有调节菌群平衡，以及抗肿瘤、抗炎和调控基因表达等作用；中链、长链脂肪酸除了作为膜脂外，还能调节能量代谢。近年来，肠道菌群与宿主相互作用是生命学科新的研究热点，肠道菌群对宿主的直接或间接生理影响尚不清楚。因此，为了更好地研究肠道微生物与宿主之间的相互作用，建立一种能同时检测多种有机酸的高灵敏度的分析方法是迫在眉睫的。此外，一些有机酸如乙酸、棕榈酸等通常会出现强烈的背景干扰，导致定量结果的不准确。评价这些背景污染，实现准确定量的工作必不可少。目前已有许多方法用于测定有机酸的含量，包括气相色谱、毛细管电泳、高效液相色谱等，对于非挥发性有机酸和中长链脂肪酸，气相色谱-质谱(gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)分析通常需要甲酯化等衍生化来增加其挥发性而被检测，但GC-MS的重现性和复杂基质解析能力使得该技术受到了一定的限制。随着分析技术的快速发展，液质联用技术因其选择性强、灵敏度高、样品前处理简单等优势，成为主流技术。
技术实现思路
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。本申请基于高灵敏度的三重四级杆质谱仪的选择反应监测(selectedreactionmonitoring，SRM)模式进行数据检测，除常见高丰度有机酸外，可以涵盖更多低含量且重要的有机酸。但脂肪酸类代谢物因缺乏特征碎片离子使此方法受限。为解决脂肪酸类代谢物缺乏特征碎片离子的问题，未衍生化的样品中挥发的有机酸在液质联用上检测不到，脂肪酸类的有机酸没有特征碎片，也难于被检测。基于以上问题，本申请引入3-硝基苯基肼(3-nitrophenylhydrazine，3-NPH)或2-硝基苯肼的衍生化反应，对羧基进行衍生化，来改善其二级质谱行为并提高仪器检测的灵敏度。本申请提供了一种基于3-NPH或2-NPH的衍生化反应，涵盖多达42种挥发性或非挥发性的有机酸的定量；本申请的定量方法是基于高灵敏度的三重四级杆质谱仪；无放射性的6个碳13稳定同位素标记13C6-3NPH衍生化试剂的引入，使每个标准品都有相应的内标，这样即保证了定量的准确性，又节省了实验成本；加入空白反应，扣除背景干扰，使得数据的可靠性得以保证。具体地，本申请提供了一种基于液质联用对多种肠道菌群有机酸进行定量的方法，所述方法包括：样品的制备，将所述样品进行预处理，然后用衍生化试剂进行衍生化；空白样品的制备；液质联用检测所述样品和所述空白样品；样品的定量分析。在本申请中，所述样品可以为新鲜肠道内容物、粪便、组织或血液。在本申请中，样品的提取可以包括：用乙腈提取样品。在本申请中，所述衍生化可以包括：将所述样品和乙腈的混合物离心，取上清液加入3-硝基苯肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和吡啶溶液，在25℃-60℃下反应15min-30min，氮气保护下吹干备用。在本申请中，当所述样品为新鲜肠道内容物、粪便或组织时，取10mg-100mg，或当所述样品为血液时，取10μL-100μL，加入0.1-1mL50％-70％乙腈(ACN)水溶液进行匀质稀释，涡旋混匀1min-3min。将混合物于3000rpm-12000rpm室温10min-20min，取40μL-100μL上清，加入10μL-50μL200mM的3-NPH的50％-70％乙腈水溶液，25μL120mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，其中溶剂为包含6％吡啶的50％-70％乙腈水溶液。在25℃-60℃下，反应15min-30min，在氮气保护下吹干备用。在本申请中，所述空白样品的制备可以包括：将乙腈、3-硝基苯肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶溶液，在25℃-60℃下反应15min-30min，氮气保护下吹干备用。在本申请中，所述空白样品的制备可以包括：取40μL-100μL50％-70％ACN，加入10μL-50μL200mM的3-NPH的50％-70％ACN溶液，25μL120mM混有6％吡啶的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)50％-70％乙腈水溶液。在25℃-60℃下，反应15min-30min，在氮气保护下吹干备用。在本申请中，在所述液质联用检测中，液相色谱条件：色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18；色谱柱温：35℃-55℃；进样量1μL-10μL；流速：0.2mL/min-0.3mL/min；流动相组成：A相为水，B相为乙腈；洗脱梯度：0-1min，2％B，1-34min，2-98％B，34-40min，98％B，40-45min，2％B，所述百分比为体积百分比。质谱条件：利用三重四级杆质谱仪的选择反应监测模式进行检测，电喷雾电离，负离子模式扫描，喷雾电压：3000V；离子传输管温度：320℃；辅助气温度：300℃；鞘气流速：35arb；辅助气体流速：10arb；质量分析器Q1和Q2的分辨率：0.7FWHM；碰撞气体压力为1.5mTorr。在本申请中，所述方法可以同时定量20-60种肠道菌群有机酸。在本申请中，所述方法可以同时定量42种肠道菌群有机酸，所述有机酸包括以下中的任一种活更多种：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、庚酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十六碳一烯酸、十七烷酸、十八烷酸、十八碳一烯酸、十八碳二烯酸、十八碳三烯酸、十九烷酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四烷酸、二十四碳一烯酸、乙酰乙酸、β-羟丁酸、柠檬酸、乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸、琥珀酸、苹果酸、草酰乙酸、丙酮酸、乳酸。在本申请中，样品的定量计算包括：以所述衍生化后的标准品的特征离子峰的峰面积与相对应的内标峰面积的比值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制内标法的标准曲线，将所述样品中的各个化合物的峰面积比值先扣除空白反应，再带入所述标准曲线，得到所述样品中有机酸的含量。在本申请的某些实施方案中，可以首先进行定性分析：通过Tracefinder软件提取样品的色谱峰和保留时间，与衍生化后的标准品出峰时间对比进行定性分析，并对所检测的化合物进行色谱峰的积分。然后，再进行定量分析：以衍生化后的标准品的特征离子峰的峰面积与相对应的内标峰面积的比值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制内标法的标准曲线。将样品中的各个化合物的峰面积比值先扣除空白反应，再带入标准曲线，得到被测样本中有机酸的绝对含量。在本申请中，所述定量分析还包括标准品母液配制：分别取上述有机酸的标准品，初始浓度为50mM，来配制有机酸的混合标准溶液，混合母液终浓度分别为200μM，用50％-70％ACN依次稀释如下浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于液质联用定量多种肠道菌群有机酸的方法，所述方法包括：样品的制备，将所述样品进行预处理，然后用衍生化试剂进行衍生化；空白样品的制备；液质联用检测所述样品和所述空白样品；样品的定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种基于液质联用定量多种肠道菌群有机酸的方法，所述方法包括：样品的制备，将所述样品进行预处理，然后用衍生化试剂进行衍生化；空白样品的制备；液质联用检测所述样品和所述空白样品；样品的定量分析。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述衍生化试剂为3-硝基苯肼或2-硝基苯肼。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品为新鲜肠道内容物、粪便、组织或血液。4.根据权利要求1所述的方法，其中，样品的提取包括：用乙腈、甲醇或乙醇提取样品。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述衍生化包括：将所述样品和乙腈的混合物离心，取上清液加入衍生化试剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶溶液，在25℃-60℃下反应15min-30min，氮气保护下吹干备用。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述空白样品的制备包括：将乙腈、衍生化试剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶溶液，在25℃-60℃下反应15min-30min，氮气保护下吹干备用。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述定量分析包括添加内标物，所述内标物用无放射性6个碳13稳定同位素标记硝基苯肼，然后再进行衍生化。8.根据权利要求1所述的方法，其中，在液质联用检测中，液相色谱条件：色谱柱：反相色谱柱；色谱柱温：35℃-55℃；进样量1μL-10μL；流速：0.2mL/min-0.3mL/min；流动相组成：A相为水，B相为乙腈；洗脱梯度：0-1min，体积比2％B，1-34min，体积比2％-98％B，34-40min，体积比98％B，40-45min，体积比2％B，质谱条件：...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓蕙，王雪颖，许丽娜，王昱松，焦玉佩，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11