一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量。本发明专利技术稳定性好、定量准确、重复性好、特异性高、适用性广。

【技术实现步骤摘要】
一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法
本专利技术涉及食品检测
，特别涉及一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法。
技术介绍
随着转基因技术的日渐成熟，转基因农产品食品产业化已呈现出较好的势头。转基因农产品食品在给人类带来巨大经济效益和社会效益的同时，也存在潜在的环境和食品安全风险。出于对转基因农产品食品安全性考虑，中国、欧盟、日本、韩国等国家和组织纷纷制定相应的法律和法规要求对转基因农产品食品和加工食品进行标识，以对人、动物的健康和生态环境多样性进行保护。由于转基因农产品食品及其产品对人类健康和生态环境可能存在潜在的不利影响，在转基因农产品食品及其产品是否有害没有定论之前，转基因农产品食品及其产品的检测是非常重要的。目前关于转基因农产品食品的检测方法主要有两种：基于蛋白质的检测方法和基于核酸的检测方法。基于蛋白质的检测方法通常是基于抗原抗体的检测方法，包括ELISA、试纸条等方法。但是上述技术均存在假阳性、假阴性、定量结果不准确的情况。由于农产品食品中基质复杂，非常容易导致抗体误将结构相似的基质蛋白质识别为Bt蛋白质，导致假阳性。在食品加工过程中，尤其是热加工过程中，蛋白质的折叠会发生变化，导致抗体无法正确识别蛋白质，导致假阴性。不同批次的抗体、同样抗体对不同的Bt蛋白亲和力都不相同，导致定量结果的不准确。基于核酸的检测方法主要指PCR技术，采用特异性引物对转入的外源基因的核苷酸序列进行扩增。依据扩增产物的有、无、多、少来判断。这种方法无法进行准确定量。同时，食品加工过程中会导致DNA的损失和破坏，影响结果的正确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有检测方法存在的缺陷，提供一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量。本专利技术先采用酶对Bt蛋白进行酶解，选择特定的酶解多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法进行定量检测，是基于特异性多肽的检测方法，虽然蛋白质的空间结构容易受食品加工而破坏，但是一级结构(多肽)稳定性非常好，因此可以避免食品加工过程对检测结果的影响。采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解具体操作如下：精确称取0.1g样品于2mlEP管，加入900mg碳酸氢铵溶液，再加入10mgDTT，50℃水浴30min，再加入30mgIAA暗处反应30min，最后加入10mg胰蛋白酶，在37℃水浴酶解4h，酶解结束后取出，加入20mg10％甲酸终止反应，最后加入人工合成的同位素标记特异性多肽10mg混匀。碳酸氢铵溶液浓度为50mM，DTT浓度为100mM，IAA浓度为100mM，胰蛋白酶浓度为500mM，人工合成的同位素标记特异性多肽浓度为1000μg/kg。用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK。用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA。用于检测Bt蛋白Cry3家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IRELFSQAESHFR；用于检测Bt蛋白Cry4家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IDESKLKPYTR；用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；用于检测Bt蛋白Cry9家族的特异性多肽的氨基酸序列为：KMLLEAVR。用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：MLALSNRMQK。同位素稀释液相色谱串联质谱法的色谱条件为：使用C18蛋白分析柱，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为B相0-9min从3％到30％，9-10min从30％到40％，10.1min升到100％保持到10.6min，10.7min回到3％保持到13min。总洗脱时间为13min，流速为0.3mL/min。同位素稀释液相色谱串联质谱法的质谱条件为：毛细管电压：3.0kv，脱溶剂温度：550℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6eV；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测盒，包括胰蛋白酶、碳酸氢铵溶液、DTT、IAA、10％甲酸及用于检测Bt蛋白的特异性多肽，用于检测Bt蛋白的特异性多肽具体如下：用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK；用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA；用于检测Bt蛋白Cry3家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IRELFSQAESHFR；用于检测Bt蛋白Cry4家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IDESKLKPYTR；用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；用于检测Bt蛋白Cry9家族的特异性多肽的氨基酸序列为：KMLLEAVR；用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：MLALSNRMQK。本专利技术的有益效果是：1、稳定性好：虽然蛋白质的空间结构容易受食品加工而破坏，但是一级结构稳定性非常好。2、定量准确：同位素稀释液相色谱串联质谱法是定量检测的黄金标准，结果准确可靠。3、重复性好：采用化学合成的多肽作为标准物质，能够批量合成，质量稳定。4、特异性高：选择多肽作为标准物质，多肽具有遗传密码特征，能够将目标多肽很好地与基质多肽区分开来。5、适用性广：Bt蛋白不是单个蛋白质，而是一大类蛋白的总称(BtCry1Aa、BtCry1Ab、BtCry1Ac、BtCry1Ah、BtCry1B、BtCry1C、BtCry1F、BtCry2A、BtCry3B和BtCry9C蛋白)，通过选择不同的多肽，可以同时定量检测多种Bt蛋白，也可以对每个Bt蛋白分别进行定量检测，满足各种检测要求。附图说明图1是Bt蛋白热变性试验图；图2是Cry1Aa转基因大豆检测图谱-1；图3是Cry1Aa转基因大豆检测图谱-2；图4是Cry1Aa转基因大豆检测图谱-3；图5是无转基因大豆检测图谱-1；图6是无转基因大豆检测图谱-2；图7是无转基因大豆检测图谱-3。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，其特征在于：采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量。

【技术特征摘要】
1.一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，其特征在于：采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量。2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解具体操作如下：精确称取0.1g样品于2mlEP管，加入900mg碳酸氢铵溶液，再加入10mgDTT，50℃水浴30min，再加入30mgIAA暗处反应30min，最后加入10mg胰蛋白酶，在37℃水浴酶解4h，酶解结束后取出，加入20mg10％甲酸终止反应，最后加入人工合成的同位素标记特异性多肽10mg混匀。3.根据权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于：碳酸氢铵溶液浓度为50mM，DTT浓度为100mM，IAA浓度为100mM，胰蛋白酶浓度为500mM，人工合成的同位素标记特异性多肽浓度为1000μg/kg。4.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK。5.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA。6.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：用于检测Bt蛋白Cry3家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IRELFSQAESHFR；用于检测Bt蛋白Cry4家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IDESKLKPYTR；用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；用于检测Bt蛋白Cry9家族的特异性多肽的氨基酸序列为：KMLLEAVR。7.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏文锋，李炀，陈一鸣，王梓昂，
申请(专利权)人：杭州老爸评测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33