一种白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的定量检测方法技术

本方案公开了本方案公开了中药材药物研究技术领域的一种白及悬浮培养细胞中2,7‑二羟基‑4‑甲氧基‑9,10‑二氢菲的定量测定方法，其中包括如下步骤：制备供试品溶液；制备对照品溶液；采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测，分别获得色谱图；依据对照品色谱图与供试品色谱图中各自的2,7‑二羟基‑4‑甲氧基‑9,10‑二氢菲峰面积，采用外标法计算所述待测白及悬浮培养细胞提取液中2,7‑二羟基‑4‑甲氧基‑9,10‑二氢菲的含量。本发明专利技术检测方法专属性强，准确稳定，重复性良好，采用该方法可以在细胞水平定量检测白及悬浮培养细胞中特定的9,10‑二氢菲类化学成分，为白及的进一步工业化高效生物合成该成分提供技术基础。

【技术实现步骤摘要】
一种白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的定量检测方法
本专利技术涉及中药材药物研究
，具体涉及一种白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的定量检测方法。
技术介绍
白及(Bletillastriata(Thunb.)Rchb.f.)为兰科白及属多年生草本植物，是历代药典收录的重要传统中药材，其味甘，性微寒，具有生肌治疮、止血收敛的功效，可用于治疗外伤出血等。9,10-二氢菲类化合物是目前报道的从白及中分离获得最多的次生代谢产物之一。该类化合物具有较高的医学研究价值，它对人癌细胞株HepG2的增殖有显著地抑制作用，同时对枯草芽孢杆菌ATCC6633、金黄色葡萄球菌ATCC25923、白色念珠菌ATCC1057及发癣菌QM248等细菌也具有良好的抑制作用。目前，利用植物细胞悬浮培养技术高效的促进细胞增殖和定向诱导次生代谢物的合成积累，已成为利用植物细胞培养生产次生代谢物最有前景的生物合成方式。但是，国内外研究对于检测白及悬浮培养细胞中的其次生代谢产物尤其是9,10-二氢菲类化合物的研究却无相关报道。白及悬浮培养细胞中普遍存在2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物，该化合物属于9,10-二氢菲类化合物。因此，建立一种可以高效、准确、稳定得定量检测白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物的方法显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术意在提供一种白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的定量检测方法，以解决现有白及细胞悬浮培养中无法精确定量测定细胞中次生代谢产物2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲累积情况的技术问题。本方案中的一种白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的定量检测方法，包括以下步骤：步骤一、取烘干后白及悬浮培养细胞，以甲醇水溶液为溶剂加热回流提取，提取液经回收溶剂后得到的残留物用甲醇水溶解转移定容，过滤，得到浓度为0.04g/ml～0.4g/ml的供试品溶液；步骤二、取2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲对照品，以甲醇水溶液为溶剂溶解，过滤，得到浓度为0.1mg/ml～0.0025mg/ml的对照品溶液；步骤三、采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测，分别获得供试品色谱图和对照品色谱图；所述检测条件具体为：色谱柱的尺寸为：柱长150mm～250mm，柱内径为2mm～5mm，色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，所述填充剂的颗粒直径为5μm～10μm；检测波长为225nm，柱温为25℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.0ml/min；流动相由流动相A和流动相B组成，其中流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，按如下条件进行洗脱：0～10min：流动相A占流动相总体积的百分比由20％增加到25％；10～25min：流动相A占流动相总体积的百分比由25％增加到50％；25～35min：流动相A占流动相总体积的百分比保持50％不变；35～50min：流动相A占流动相总体积的百分比由50％增加到100％；50～60min：流动相A占流动相总体积的百分比保持100％不变；步骤四、依据所述对照品色谱图与所述供试品色谱图中各自的2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲峰面积，采用外标法计算所述待测白及悬浮培养细胞提取液中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的含量；其中，所述甲醇水溶液的浓度为70％～100％。在本方案所限定的检测波长、柱温、流速、色谱柱等因素下，结合在上述流动相条件，可有效基线分离待测次生代谢产物2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物，保留时间合适，出峰位置无干扰，且峰形良好，从而能够准确的测定出白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的含量。通过该方法可以获得白及悬浮培养细胞中有效的药用成分2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物含量变化的信息，为后续定向诱导调控白及悬浮培养细胞生成2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物，利用液体悬浮培养工业化产2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物提供技术支持。进一步，本方案中还包括制备定位用对照品溶液的步骤，取不同质量的2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲对照品配置成不同质量浓度的对照品溶液，以甲醇水溶液为溶剂溶解即得；采用步骤三所述高效液相色谱法检测所述定位所用对照品溶液，获得定位用对照品色谱图；步骤四依据所述定位用对照品色谱图与所述供试品色谱图中各自的2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲峰及峰面积，采用外标法计算所述待测白及悬浮培养细胞提取液中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲峰的含量。进一步，步骤一中白及悬浮培养细胞由继代培养3～4代30～45天生长良好、质地疏松、生长状况一致的白及愈伤组织作为液体悬浮培养的外植体悬浮培养而来；悬浮培养基为MS+6-苄氨基嘌呤1.5±0.45mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸2.5±0.5mg/L+30±20g/L蔗糖，悬浮培养基的pH为6.0±0.2；外植体的接种量与培养基的体积比例为1/80～1/20g/mL；接种后在转速为120±10r/min、温度为25±2℃的黑暗条件下进行振荡悬浮培养，悬浮培养时间为35～40天。在该培养条件下，白及悬浮培养细胞生物合成累积2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的累积效率可以达到相对最大值。进一步，步骤一中甲醇水溶液的浓度为70％，回流提取1～3次，每次提取2～4小时。进一步，步骤一中采用浓度为70％的甲醇回流提取2次，每次提取3小时。利用该提取条件提取，样品中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物提取充分，并且提取过程耗能少。进一步，步骤三中，所述供试品溶液与所述对照品溶液的进样量均为20μl。进一步，步骤一中供试品溶液的浓度为0.4g/ml；步骤二中对照品溶液的浓度0.025g/ml。在供试品溶液浓度为0.4g/ml的条件下白及悬浮培养细胞供试品提取物可以全部溶解在70％甲醇水溶液中，且进样量为20μl时供试品溶液中待测的2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物的峰面积大小合适。且在0.025g/ml对照品溶液的峰面积大小与0.4g/ml供试品溶液中待测的9,10-二氢菲类化合物的的峰面积大小相近。合适的峰面积大小使测定准确,避免检测误差。进一步，步骤三中，柱温为25℃，流速为0.8ml/min。在该检测条件下，可以更为有效准确的测定2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物的峰面积。进一步，步骤三中，柱长为250mm，柱内径为4.6mm，填充剂的颗粒直径为5μm。使用该型色谱柱，可以同时满足2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲化合物的测量条件与仪器的限制和要求。附图说明图1为实施例中白及悬浮培养细胞的供试品色谱图；图2为实施例中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲对照品色谱图；图3为实施例中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲对照品线性关系图。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细的说明：本专利技术白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白及悬浮培养细胞中2,7‑二羟基‑4‑甲氧基‑9,10‑二氢菲的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、取烘干后白及悬浮培养细胞，以甲醇水溶液为溶剂加热回流提取，提取液经回收溶剂后得到的残留物用甲醇水溶液溶解转移定容，过滤，得到浓度为0.04g/ml～0.4g/ml的供试品溶液；步骤二、取2,7‑二羟基‑4‑甲氧基‑9,10‑二氢菲对照品，以甲醇水溶液为溶剂溶解，过滤，得到浓度为0.1mg/ml～0.0025mg/ml的对照品溶液；步骤三、采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测，分别获得供试品色谱图和对照品色谱图；所述检测条件具体为：色谱柱的尺寸为：柱长150mm～250mm，柱内径为2mm～5mm，色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，所述填充剂的颗粒直径为5μm～10μm；检测波长为225nm，柱温为25℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.0ml/min；流动相由流动相A和流动相B组成，其中流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，按如下条件进行洗脱：0～10min：流动相A占流动相总体积的百分比由20％增加到25％；10～25min：流动相A占流动相总体积的百分比由25％增加到50％；25～35min：流动相A占流动相总体积的百分比保持50％不变；35～50min：流动相A占流动相总体积的百分比由50％增加到100％；50～60min：流动相A占流动相总体积的百分比保持100％不变；步骤四、依据所述对照品色谱图与所述供试品色谱图中各自的2,7‑二羟基‑4‑甲氧基‑9,10‑二氢菲峰面积，采用外标法计算所述待测白及悬浮培养细胞提取液中2,7‑二羟基‑4‑甲氧基‑9,10‑二氢菲的含量；其中，所述甲醇水溶液的浓度为70％～100％。...

【技术特征摘要】
1.一种白及悬浮培养细胞中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、取烘干后白及悬浮培养细胞，以甲醇水溶液为溶剂加热回流提取，提取液经回收溶剂后得到的残留物用甲醇水溶液溶解转移定容，过滤，得到浓度为0.04g/ml～0.4g/ml的供试品溶液；步骤二、取2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲对照品，以甲醇水溶液为溶剂溶解，过滤，得到浓度为0.1mg/ml～0.0025mg/ml的对照品溶液；步骤三、采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测，分别获得供试品色谱图和对照品色谱图；所述检测条件具体为：色谱柱的尺寸为：柱长150mm～250mm，柱内径为2mm～5mm，色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，所述填充剂的颗粒直径为5μm～10μm；检测波长为225nm，柱温为25℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.0ml/min；流动相由流动相A和流动相B组成，其中流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，按如下条件进行洗脱：0～10min：流动相A占流动相总体积的百分比由20％增加到25％；10～25min：流动相A占流动相总体积的百分比由25％增加到50％；25～35min：流动相A占流动相总体积的百分比保持50％不变；35～50min：流动相A占流动相总体积的百分比由50％增加到100％；50～60min：流动相A占流动相总体积的百分比保持100％不变；步骤四、依据所述对照品色谱图与所述供试品色谱图中各自的2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲峰面积，采用外标法计算所述待测白及悬浮培养细胞提取液中2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲的含量；其中，所述甲醇水溶液的浓度为70％～100％。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：还包括制备定位用对照品溶液的步骤，制备所述定位用对照品溶液具体为取不...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐德林，潘胤池，肖世基，李林，上官艳妮，刘厚伯，姚文柯，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52