本发明专利技术涉及一种硫酸乙酰肝素/肝素（HS/Hp）的不同区域寡糖的制备及纯化方法。所述方法以市售肝素为原料，利用肝素酶Ⅰ特异性酶解含有3个亚硫酸根的高硫二糖，精确控制酶解反应条件达到部分酶解，得到含高硫二糖的高硫酸化区域寡糖，同时也使得HS/Hp中含NS和NAc结构的低度硫酸化寡糖片段富集下来，从而制备了系列含不同结构的低硫酸化区域寡糖。通过凝胶色谱法和离子交换高效液相色谱分离提纯了二糖至十糖一系列低度硫酸化的HS/Hp寡糖。本发明专利技术建立的制备HS/Hp的不同区域寡糖的方法快速简便，并且成本低，为HS/Hp的结构与功能研究提供重要的糖库样品，也为肝素类新型药物的开发提供了重要的前驱体。
【技术实现步骤摘要】
硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法
本专利技术提供硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法，属于天然产物制备纯化领域。
技术介绍
硫酸乙酰肝素（HS）和肝素（Hp）是糖胺聚糖（GAG）家族中最复杂的碳水化合物，主要由不同的二糖单元通过β（1-4）糖苷键交替连接形成的线性硫酸化的多糖。HS长链中含有3种不同硫酸化程度的区域，高硫酸化区域(S-domain)、低度硫酸化(NA/NSdomain)以及无硫区域(NAdomain)，它们交替排列组成了复杂的链状结构。而Hp长链的70-80%为高硫二糖与HS的高硫区域结构相似。研究发现，HS/Hp的高度硫酸化和低度硫酸化区域利用自身的特异结构和序列与许多活性蛋白质的相互作用调控着许多重要生物功能，如细胞的生长调控、信号传导，细胞粘附和迁移，炎症，抗凝，神经发育和再生等。它们的生物学意义使HS/Hp成为新型药物（如抗肿瘤抗病毒药物等）开发的重要靶标。因此对不同硫酸化区域的HS/Hp寡糖的制备及其结构鉴定对HS/Hp的结构与功能的研究提供重要的标准糖库样品，也为肝素类新型药物的开发提供了重要的前驱体。肝素酶对HS和Hp二糖具有不同的底物特异性，其中肝素酶I对含有高硫二糖具有酶解特异性。近年来已有报道利用肝素酶I通过完全酶解肝素来制备含有稀有结构的肝素寡糖。但是未见制备HS/Hp的不同区域寡糖的报道。本专利技术利用肝素酶I的底物特异性通过控制酶反应条件达到不同程度的部分酶解，以同时制备一系列含有不同结构高度硫酸化和低度硫酸化区域的寡糖片段。因此本专利技术在制备路线和技术方法上具有创新性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法，以肝素为原材料，利用肝素酶Ⅰ能特异性酶解含有3个亚硫酸根的高硫二糖，精确地控制酶解反应条件达到部分酶解，得到含高硫二糖的高度硫酸化区域寡糖，同时也使得HS/Hp中含NS和NAc结构的低度硫酸化寡糖片段富集下来，从而制备了系列含不同结构的低硫酸化区域寡糖。通过凝胶色谱法分离收集得到不同聚合度的HS/Hp肝素粗样品，除掉流动相中的NH4HCO3后，再用离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）分离收集得到低度硫酸化HS/Hp肝素寡糖纯品。本专利技术的具体技术方案为：一种HS/Hp不同区域寡糖的制备及纯化方法，其步骤为：(1)以肝素为原料，利用肝素酶Ⅰ部分酶解制备一系列含不同区域结构的寡糖；(2)酶解产物用凝胶色谱法分离收集，后经除流动相、冷冻干燥，得到不同聚合度的HS/Hp寡糖粗样品。(3)用SAX-HPLC方法分别对步骤（2）中得到HS/Hp寡糖粗样品进一步的细分；经除盐与冷冻干燥之后得到纯化的HS/Hp寡糖。(4)再将步骤(2)收集得到的HS/Hp寡糖粗样品分别加入肝素复合酶完全酶解，用SAX-HPLC法对其进行二糖组分分析鉴定。具体步骤如下：步骤（1）的具体步骤为：称量50-200mg市售肝素溶解在5-10mLTris-HCl缓冲液，加入10-60mIU肝素酶I于36-40℃加热酶解24h后终止反应，12000r／min离心10min，取上清液，冷冻干燥。步骤（2）的具体步骤为：利用凝胶色谱层析柱分离步骤（1）的酶解样品140mg，以0.1-0.2MNH4HCO3为流动相，洗脱流速15-18mL/h，以UV232nm检测，分别收集二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的洗脱峰；所收集的对应的洗脱液在50-60℃烘箱挥发NH4HCO3，-80℃冷冻干燥，分别得到含有不同区域结构不同聚合度的二糖、四糖、六糖、八糖、十糖寡糖粗样品。步骤（3）的具体步骤为：将步骤（2）中制备的HS/Hp寡糖粗样品各50-100ug分别溶解于pH3.0-4.0的水，用SAX-HPLC法在不同NaCl浓度浓度下线性梯度洗脱，分离收集HS/Hp寡糖，分别透析、冷冻干燥，得到HS/Hp寡糖纯品。步骤（4）的具体步骤为：取步骤（2）制备的HS/Hp寡糖粗样品各30-80ug，分别加入2-4mIU肝素酶Ⅰ、2-4mIU肝素酶Ⅱ和2-4mIU肝素酶Ⅲ，进行完全酶解，反应体系为80-150uL醋酸钠缓冲液（含有0.1mol/L醋酸钠、0.1mmol/L醋酸钙和100ug/mL的牛血清蛋白，pH7.0)，酶解产物用SAX-HPLC法分析并确定二糖组分。具体操作步骤如下：1.硫酸乙酰肝素/肝素（HS/Hp）寡糖的制备称量50-200mg市售肝素溶解在5-10mLTris-HCl缓冲液（含20mmol/LTirs和5mmol/L氯化钙，pH7.40)，加入10-60mIU肝素酶I于36-40℃酶解24h，100℃灭活5min终止反应终止反应,12000r／min离心10min，取上清液，冷冻干燥。HS/Hp寡糖的分离收集取步骤1冻干样140mg用3mL0.1-0.2MNH4HCO3溶解，过聚丙烯酰胺凝胶色谱柱(Bio-GelP-10)，以0.1-0.2MNH4HCO3为流动相，洗脱流速15-18mL/h，用UV232nm检测收集，分别收集二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的洗脱峰。所得的各个寡糖组分洗脱液在50-60℃烘箱去除NH4HCO3（本步骤重复3次），-80℃真空冷冻干燥后得到含不同区域结构不同聚合度的系列HS/Hp寡糖粗样品。HS/Hp寡糖的细分取步骤2制备的二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的HS/Hp寡糖粗样品各50-100ug，分别溶解于pH3.0-4.0的水，利用SAX-HPLC，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集HS/Hp寡糖。把收集到的肝素寡糖分别装入相应规格的透析膜，在超纯水中透析3天后，冷冻干燥得到二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的HS/Hp寡糖纯品。SAX-HPLC方法具体参数为：色谱柱为ProPacPA1（4×250mm）；流动相：A相为pH3.5H2O，B相为pH3.52MNaCl；流速1-1.5mL/min；UV232nm检测。HS/Hp寡糖二糖组分分析把步骤（2）中制备的二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的HS/Hp寡糖各取30-80ug，别加入2-4mIU肝素酶Ⅰ、2-4mIU肝素酶Ⅱ和2-4mIU肝素酶Ⅲ，进行完全酶解，反应体系为80-150uL醋酸钠缓冲液（含有0.1mol/L醋酸钠、0.1mmol/L醋酸钙和100ug/mL的牛血清蛋白，pH7.0)，37℃水浴反应24小时，100℃灭活5min终止反应。酶解产物用SAX-HPLC分析，色谱柱为ProPacPA1（4×250mm），流动相:A相为pH3.5H2O，B相为pH3.52MNaCl，UV232nm检测，流速1mL/min，线性梯度洗脱。检测图谱和标样二糖图谱比对，确定二糖组分，从而进行结构鉴定。本专利技术的优点在于：利用肝素酶I的底物特异性，通过控制酶反应条件达到不同程度的部分酶解，以同时制备一系列含有不同结构高度硫酸化和低度硫酸化区域的寡糖片段。本专利技术在制备路线和技术方法上未见报道，具有创新性。附图说明图1聚丙烯酰胺凝胶色谱柱（Bio-GelP-10）分离HS/Hp寡糖色谱图。图2强阴离子高效液相色谱法分析dp2色谱图。图3强阴离子高效液相色谱法分析dp4色谱图。图4强阴离子高效液相色谱法分析dp6色谱图。图5强阴离子高效液相色谱法分析dp8色谱图。图6本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法，其特征在于：具体步骤如下：1）硫酸乙酰肝素/肝素的区域寡糖的制备：以肝素为原料，通过控制肝素酶I酶解反应条件达到部分酶解以制备硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖；酶解条件为：50‑200 mg肝素溶解在5‑10mL Tris‑HCL缓冲液，加入10‑60 mIU肝素酶I于36‑40℃加热酶解24 h后终止反应，12000 r／min离心10 min，取上清液，冷冻干燥；2）硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的分离收集：利用聚丙烯酰胺凝胶色谱柱，以0.1‑0.2M NH4HCO3流动相，洗脱流速15‑18 mL/h，并在UV 232 nm下测量洗脱液的吸光度，分离步骤1）酶解得到的酶解样品，分别收集二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的洗脱峰；接着将各洗脱峰收集的洗脱液于50‑60 ℃烘箱挥发流动相NH4HCO3，‑80 ℃冷冻干燥，分别得到不同区域的二糖、四糖、六糖、八糖和十糖粗样品；3）硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的细分：分别取步骤2）中收集的硫酸乙酰肝素/肝素寡糖粗样品各50‑100 ug溶解于pH 3.0‑4.0的水中，用强阴离子高效液相色谱法，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集对应的硫酸乙酰肝素/肝素寡糖；把收集到的各寡糖装入相应规格的透析膜，在超纯水中透析3天后，冷冻干燥分别得到二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的硫酸乙酰肝素/肝素寡糖纯品。...
【技术特征摘要】
1.一种硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法，其特征在于：具体步骤如下：1）硫酸乙酰肝素/肝素的区域寡糖的制备：以肝素为原料，通过控制肝素酶I酶解反应条件达到部分酶解以制备硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖；酶解条件为：50-200mg肝素溶解在5-10mLTris-HCL缓冲液，加入10-60mIU肝素酶I于36-40℃加热酶解24h后终止反应，12000r／min离心10min，取上清液，冷冻干燥；2）硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的分离收集：利用聚丙烯酰胺凝胶色谱柱，以0.1-0.2MNH4HCO3流动相，洗脱流速15-18mL/h，并在UV232nm下测量洗脱液的吸光度...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏峥，苏晓明，梁群焘，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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