一种制备小分子透明质酸或其盐的方法技术

本发明专利技术公开了一种小分子透明质酸或其盐的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术使用由菌种保藏号为CGMCC NO.16836的植物乳杆菌发酵生产制得透明质酸酶溶液，该透明质酸酶溶液酶解分子量介于500kDa‑700kDa透明质酸或其盐，制得小分子透明质酸或其盐的分子量介于1kDa‑60kDa；小分子透明质酸酶解液经酶灭活、活性炭吸附除杂、过滤微孔膜滤、低温喷雾干燥得到小分子透明质酸或其盐。本发明专利技术所得产品安全性高、透皮吸收性好、极大保证了分子结构的完整性及生物活性，应用广泛。

A method for preparing small molecule hyaluronic acid or its salt

The invention discloses a preparation method of small molecule hyaluronic acid or its salt, which belongs to the field of bioengineering technology. The hyaluronidase solution is produced by fermentation of Lactobacillus plantarum with the preservation number CGMCC NO.16836. The molecular weight of the hyaluronidase solution is between 500 kDa and 700 kDa, and the molecular weight of the small molecule hyaluronic acid or its salt is between 1 kDa and 60 kDa. The small molecule hyaluronidase hydrolysate is inactivated by enzyme, adsorbed by activated carbon and filtered by microporous membrane. Low molecular weight hyaluronic acid or its salts were obtained by filtration and low temperature spray drying. The product of the invention has high safety, good transdermal absorption, greatly guarantees the integrity of molecular structure and biological activity, and is widely used.

【技术实现步骤摘要】
一种制备小分子透明质酸或其盐的方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种制备小分子透明质酸或其盐的方法。
技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid,HA)，是一种酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。近年来研究发现，小分子透明质酸表现出非常强的生物活性(HuiZM，abioactivehyaluronicacidfragment，itsmanufacturemehtod，itsformulationanditsapplications，Patentnumber2014101553593.5.)，具有提高皮肤免疫功能、消除皮肤炎症、促进创口愈合、治疗急慢性咽喉炎、治疗牙龈炎等作用，是免疫细胞、细胞因子的激活剂。小分子透明质酸渗透吸收性好，极易被真皮、肠道吸收，可以迅速补充体内流失的透明质酸。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。随着小分子透明质酸的研究与应用的推广，近年来，国内外开始重视HA的降解及其降解产物的制备研究。目前，降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类。物理降解方法主要有加热、机械剪切力、紫外线、超声波、微波、60Co照射、γ-射线辐射等因素，均可使HA发生降解。但是，物理法制备的分子量高于1万，产生的分子量范围分布较大，产品稳定性较差。HA的化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解(HCL)和碱(NaOH)水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。尽管使用化学降解方法降解产物的相对分子质量可以通过改变酸碱或氧化剂的加入量和反应时间来控制，降解成本较低，易于大规模生产，但化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给HA性质产生影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。生物酶法降解是在透明质酸酶的作用下β-糖苷键断裂发生降解。酶法降解温和，是制备小分子透明质酸的最佳技术手段。透明质酸酶又叫玻璃酸酶，是可使HA发生低分子化作用的糖苷酶，也能降解其他机体组织中的酸性粘多糖，其广泛存在于真核生物和原核生物中，具有特异性的生理学活性。如申请号为CN201611127881.9的专利技术专利提供了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，通过酶法实现对透明质酸酶解。但是，目前的透明质酸酶通常是从动物组织中提取制备，价格昂贵，不适合工业化应用。因此，一种低成本、工艺简单、适合工业化大规模生产的小分子透明质酸的方法具有重要的应用潜力。同时透明质酸提取工艺多为有机试剂沉淀法，此方法造成环境污染，能耗大，并且提取小分子的透明质酸收率低。此外还有运用喷雾干燥，进行透明质酸提取，但是一般的喷雾干燥机，进风温度在180℃以上，热敏性的物料，物理性质或化学性质易发生变化，特别是生物活性材料，如细菌、活性酶等会失活，
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种制备小分子透明质酸或其盐的方法。本专利技术通过植物乳杆菌产生的透明质酸酶配合低温喷雾干燥，降解得到小分子透明质酸或其盐。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：一种制备小分子透明质酸或其盐的方法，包括以下步骤：(1)酶解反应液：向纯化水中加入透明质酸酶，开启搅拌，缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，通过酶解反应得酶解液，所述透明质酸酶为植物乳杆菌诱变菌株CnT012-56发酵生产制得；该菌株分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，其保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年11月28日，保藏编号：CGMCCNO.16836；(2)透明质酸酶灭活：将步骤(1)酶解液升温处理，使所述酶解液中透明质酸酶变性失活。(3)吸附：将步骤(2)中酶解液进行吸附。(4)过滤纯化：将步骤(3)混合液去除吸附剂及其变性透明质酸酶，过滤得到纯净小分子透明质酸及其盐溶液。(5)低温喷雾干燥：将步骤(4)小分子透明质酸及其盐溶液进行低温喷雾干燥，得到所需分子量的小分子透明质酸及其盐固体粉末。进一步的，步骤(1)中首先向纯化水中加入透明质酸酶，开启搅拌，调节pH为5-8，温度为30-40℃，缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，使质量体积浓度达到50-100g/L，降解反应0.5-1.5h后，继续缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，使质量体积浓度达到100-200g/L，继续酶解到所需分子量，优选为继续酶解5-8h。采用分步加入透明质酸或其盐固体粉末，可以确保透明质酸或其盐固体粉末溶解以及与透明质酸酶作用，保证酶解效果。进一步的，步骤(1)中透明质酸酶添加量为每克透明质酸或其盐加102-105IU。采用该比例主要是由于过高的透明质酸酶添加量会导致透明质酸或其盐酶解过快，造成产物分子量不均，而过低的透明质酸酶添加量无法保证酶解效果。进一步的，步骤(2)中透明质酸酶变性失活条件为酶解液升温至45-80℃下维持5-60min。采用该条件，确保透明质酸酶变性失活。进一步的，步骤(3)中酶解液吸附条件为0.01％-1％活性炭，吸附30-90min，步骤(4)中采用孔径0.22μm的纤维素滤膜过滤。采用0.22μm的纤维素可以最大限度的将活性炭和透明质酸酶过滤掉，保证后续产品的纯度。进一步的，透明质酸盐固体粉末为透明质酸钠，调节pH为5-8用盐酸或氢氧化钠溶液调节。采用盐酸或氢氧化钠溶液调节，一方面保证最终产物的安全性，另一方面可以降低生产成本。进一步的，步骤(4)中小分子透明质酸或其盐溶液最终浓度为10％-20％，该浓度与低温喷雾干燥法相匹配，保证后续干燥过程的正常运行。进一步的，步骤(5)中喷雾干燥法制备小分子透明质酸或其盐固体粉末条件为进风温度40℃-80℃，出风温度40℃，进料速度100mL/h–300mL/h。该方法适用于酶解分子量介于500kDa-700kDa透明质酸或其盐，制得小分子透明质酸或其盐的分子量介于1kDa-60kDa。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供了一种透明质酸酶解反应体系的建立。本专利技术所涉及透明质酸酶来源于植物乳杆菌，植物乳杆菌作为一种益生菌可应用于食品中，所产透明质酸酶具有高安全性，其降解制备的小分子透明质酸或其盐安全可靠，非常适用于食品、化妆品及医药行业。(2)本专利技术还提供了酶解液灭活纯化的方式，透明质酸酶灭活方法为将酶解液升温使透明质酸酶变性失活，酶解液纯化方法为用活性炭，吸附，再采用纤维素滤膜过滤酶解液，采用该方法方便快捷，实现了高效灭活纯化。(3)本专利技术还提供了制备小分子透明质酸固体粉末的方法，低温喷雾干燥法。该方法相较于传统醇沉方式，收率高、无污染、能耗低、无有机溶剂残留；并且该方法相比于传统的干燥法，喷雾干燥在物料低于80℃下完成，进风温度最低能做到40℃左右，采取该方法制备小分子透明质酸，最大限度保存了分子的结构完整和生物活性。(4)同时该发方法制备的小分子透明质酸质量好，透明质酸固体粉末白度在93％以上，水分含量为小于3.3％，分子量介于1kDa-60kDa；纯度高，含量97％以上，收率高，可高达90％。具体实施方式为了使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)酶解反应液：向纯化水中加入透明质酸酶，开启搅拌，缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，通过酶解反应得酶解液，所述透明质酸酶为植物乳杆菌诱变菌株CnT012‑56发酵生产制得，该菌株分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，其保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年11月28日，保藏编号：CGMCC NO.16836；(2)透明质酸酶灭活：将步骤(1)酶解液升温处理，使所述酶解液中透明质酸酶变性失活；(3)吸附：将步骤(2)中酶解液进行吸附；(4)过滤纯化：将步骤(3)混合液去除吸附剂及其变性透明质酸酶，过滤得到纯净小分子透明质酸及其盐溶液；(5)低温喷雾干燥：将步骤(4)小分子透明质酸及其盐溶液进行低温喷雾干燥，得到所需分子量的小分子透明质酸及其盐固体粉末。

【技术特征摘要】
1.一种制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)酶解反应液：向纯化水中加入透明质酸酶，开启搅拌，缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，通过酶解反应得酶解液，所述透明质酸酶为植物乳杆菌诱变菌株CnT012-56发酵生产制得，该菌株分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，其保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年11月28日，保藏编号：CGMCCNO.16836；(2)透明质酸酶灭活：将步骤(1)酶解液升温处理，使所述酶解液中透明质酸酶变性失活；(3)吸附：将步骤(2)中酶解液进行吸附；(4)过滤纯化：将步骤(3)混合液去除吸附剂及其变性透明质酸酶，过滤得到纯净小分子透明质酸及其盐溶液；(5)低温喷雾干燥：将步骤(4)小分子透明质酸及其盐溶液进行低温喷雾干燥，得到所需分子量的小分子透明质酸及其盐固体粉末。2.根据权利要求1所述制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于：步骤(1)中首先向纯化水中加入透明质酸酶，开启搅拌，调节pH为5-8，温度为30-40℃，缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，使质量体积浓度达到50-100g/L，降解反应0.5-1.5h后，继续缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，使质量体积浓度达到100-200g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩秀云，
申请(专利权)人：山东安华生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37