本发明专利技术公开了一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用。所述包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞表达透明质酸酶，所述透明质酸酶为：a)锚定于所述免疫细胞上的全长蛋白；或b)分泌至所述免疫细胞外的可溶型蛋白。本发明专利技术还公开所述的免疫细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术的包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞，可以改变微环境的细胞外基质结构正常化肿瘤免疫微环境的效果，从而使得其可以有效接近并杀死肿瘤细胞。在可溶性PH20蛋白的帮助下，包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞也能改善肿瘤微环境，有效杀死肿瘤细胞。
【技术实现步骤摘要】
一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用
本专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用。
技术介绍
癌症，又称恶性肿瘤，它是严重危害人类健康、导致现代人类死亡的第一大恶疾和顽症。据联合国统计数据显示，目前全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症，这比艾滋病、结核病和疟疾导致的死亡人数还要高。而且每年全球还有1000多万人被确诊患上癌症(世界卫生组织发布的《2014年世界癌症报告》)。一直以来，肿瘤治疗的基础都是手术、化疗以及放疗。然而传统的治疗方式仅能延长恶性肿瘤患者的生存期，治愈的可能性很低，恶性肿瘤依然是“绝症”。在过去20年中，通过特异性识别肿瘤细胞表面特异性蛋白、从而杀死肿瘤细胞的靶向疗法比如西妥昔单抗和曲妥珠单抗治疗方法，使得它们成为很多癌症的标准治疗方法，然而上述方法并不能够有效治疗实体瘤。但在过去几年中，免疫疗法，一种通过招募并加强病人的免疫系统以攻击肿瘤的方法，已经成为肿瘤治疗方法的第5大支柱。其中，最热门且目前最接近FDA获批的治疗方法为CAR-T细胞治疗方法。然而，直到最近，CAR-T细胞治疗法一直局限于小规模的临床试验，并且大部分是用于晚期血液癌症的治疗，而除淋巴瘤以外的恶性实体肿瘤效果不佳。CAR-T细胞用于实体瘤治疗的最大障碍在于肿瘤免疫抑制微环境，是肿瘤发生发展过程中形成的内环境。恶性实体肿瘤主要由癌/瘤细胞和基质细胞(例如成纤维细胞和炎症细胞)细胞外基质及血管/淋巴管构成。与正常组织相比，肿瘤组织中的基质细胞、细胞外基质和血管/淋巴管系统一般是异常的，具有增加数目的成纤维细胞，并且血管系统呈现出高度分支或卷曲的结构。肿瘤和基质细胞产生并装配细胞外基质组分(胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸)形成致密团块(ClinOncol31:2205-2218.2013)。以上因素造成了肿瘤组织结构致密、营养缺乏、pH偏低、缺氧，抑制了CAR-T细胞有效发挥肿瘤杀伤作用。想要有效治疗肿瘤，CAR-T细胞必须能够克服上述微环境，进入到肿瘤组织、在肿瘤组织中存活并对肿瘤细胞进行杀伤。尽管可能已经产生了针对肿瘤微环境的CAR-T细胞，即表达透明质酸酶PH20的CAR-T细胞(专利CN107400664A)，但是这种细胞产生的技术手段存在问题，发挥杀伤作用的原理及技术效果未得到揭示。首先，在透明质酸酶的设计上，CN107400664A认为：在自然状态下，透明质酸酶是以分泌蛋白质形式(即游离透明质酸酶)而不是以跨膜蛋白质的形式表达，这种分泌型透明质酸酶或者透明质酸酶跨膜融合蛋白质基因序列中的透明质酸酶编码序列可以是全部蛋白质编码序列，也可以是含有编码透明质酸酶活性的部分序列。但未公布制备分泌透明质酸酶PH20CAR-T细胞的技术手段，且指出了与游离型扩散的透明质酸酶相比较，跨膜型透明质酸酶疗效更好。其次，在具体实施例中公开的表达透明质酸酶跨膜融合蛋白的CAR-T细胞制备方法，即采用透明质酸酶PH20跨膜融合蛋白慢病毒感染CAR-T细胞，通过透明质酸酶抗体磁珠分离得到表达跨膜透明质酸酶的CAR-T细胞。该PH20跨膜融合蛋白的编码序列由PH20-人IgG4铰链区-CD8跨膜区-CD28胞内区-4-1BB胞内区-CD3ζ胞内序列依次组成。但其未公布该CAR-T细胞的透明质酸降解活性，CAR-T细胞的肿瘤细胞杀伤活性，CAR-T细胞的体内肿瘤抑制活性。本专利技术人通过实验发现，采用CN107400664A公开的表达透明质酸酶跨膜融合蛋白的制备方法很难获得具有透明质酸酶活性的CAR的阳性细胞；另一方面，采用两个慢病毒分别感染T细胞后，T细胞状态差，CAR阳性细胞几乎无法检测到透明质酸酶活性。鉴于以上缺陷，现有技术中亟待需要一种有效的包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服目前现有技术当中无法得到具有透明质酸降解活性的CAR-T细胞、同时CAR的阳性率也很低或者含有透明质酸酶的CAR-T细胞难以分泌透明质酸酶，因而无法得到有效的包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞的缺陷，提供一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用。所述免疫细胞可以进入实体瘤内部杀死肿瘤细胞；在可溶型PH20蛋白的帮助下，包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞也能进入实体瘤内部，杀死肿瘤细胞。本专利技术提供一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞，其表达透明质酸酶，所述透明质酸酶为：a)锚定于所述免疫细胞上的全长蛋白；或b)分泌至所述免疫细胞外的可溶型蛋白。透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族。在人类中，存在编码具有不同性质和位置的透明质酸酶的6个基因，HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYAL5(又被称为SPAM1或者PH-20)、HYAL6(又被称为HYALP1)。同工型HYAL1和HYAL2存在于大多数组织中。HYAL2为GPI膜锚定蛋白，主要负责剪切高分子透明质酸，得到的小片段透明质酸被细胞内吞至内溶酶体(Endolysosome)后，被HYAL1进一步降解。在肿瘤组织中，透明质酸由透明质酸合成酶合成(HAS1、HAS2以及HAS3)。HYAL3存在于骨髓和睾丸中，但是其功能还没有被良好地表征。透明质酸酶PH20在睾丸中高表达，并参与卵母细胞被精子受精的过程。所述透明质酸酶较佳地为哺乳动物睾丸透明质酸酶；更佳地为人类睾丸透明质酸酶，也被称为SPAM1、精子黏附分子1或者PH20。编码所述PH20的基因产生两种转录变体，分别对应两种形式的酶序列：一种形式为包含膜锚定序列的PH20序列，该所述PH20序列可以锚定在包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞的表面。因此，获得了表达细胞膜锚定PH20的包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞；本专利技术中所述透明质酸酶的氨基酸序列较佳地如序列表中SEQIDNO.1所示，编码该所述PH20的核苷酸序列较佳地如序列表中SEQIDNO.2或者3所示。另一种形式为缺失了对应于羧基端膜结合结构域的序列，所述缺失后的序列的最后一位氨基酸通常位于全长序列的第430～454位，以产生可溶型PH20，该羧基端结构域的缺失导致透明质酸酶分泌到细胞外介质。因此，获得了表达在中性及偏酸性pH条件下具有酶活性的分泌性透明质酸酶的包含CAR或者TCR的T细胞或者NK细胞，所述的NK细胞为NK-92细胞；该种形式的透明质酸酶的氨基酸序列为如序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第1～447位；较佳地，其核苷酸序列为如序列表中SEQIDNO.2或者SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的第1～1341位。所述的肿瘤抗原识别受体为嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)，其中：所述的TCR包含，如TCR的α链、TCR的β链、TCR的γ链、TCR的δ链或它们的组合，所述α链包含可变区和恒定区，较佳地，所述可变区为人TCRα链的可变区，所述恒定区鼠α链的恒定区，较佳地，所述β链包含可变区和恒定区，所述可变区为人TCRβ链的可变区，所述恒定区为鼠β链的恒定区；其中，所述TCR的α链和所述TCR的β链之间可以通过接头序列连接，所述接头序列可以为P2A、T2A、E2A、F2A或者IRES；更佳地为E6TCR。所述的CAR所包括的胞内区、铰链区以及跨膜区均可为本领域常规，所述的CAR的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞，其表达透明质酸酶，其特征在于，所述透明质酸酶为：a)锚定于所述免疫细胞上的全长蛋白；或b)分泌至所述免疫细胞外的可溶型蛋白。
【技术特征摘要】
2017.12.13 CN 20171132996741.一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞，其表达透明质酸酶，其特征在于，所述透明质酸酶为：a)锚定于所述免疫细胞上的全长蛋白；或b)分泌至所述免疫细胞外的可溶型蛋白。2.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述的b)优选为a)缺失了羧基端膜结构后获得；较佳地，所述的透明质酸酶为哺乳动物睾丸透明质酸酶，更佳地为人透明质酸酶HYAL1、HYAL2、SPAM1或者PH20；进一步更佳地：所述a)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；编码所述a)的核苷酸序列优选如序列表中SEQIDNO.2或者SEQIDNO.3所示；所述b)的氨基酸序列为如序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第1～447位；编码所述b)的核苷酸序列优选为如序列表中SEQIDNO.2或者SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的第1～1341位。3.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述的肿瘤抗原识别受体为嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)，较佳地：所述的TCR包含TCR的α链、TCR的β链、TCR的γ链和TCR的δ链中的一种或多种，所述α链包含可变区和恒定区；较佳地，所述可变区为人TCRα链的可变区，所述恒定区为鼠α链的恒定区；所述β链包含可变区和恒定区，所述可变区为人TCRβ链的可变区，所述恒定区为鼠β链的恒定区；更佳地，所述的TCR为E6TCR；和/或，所述的CAR的胞内区包括人的4-1BB胞内区和/或人的CD28胞内区，以及人的CD3ζ胞内区，优选为人的4-1BB胞内区、人的CD28胞内区，以及人的CD3ζ胞内区；和/或，所述的CAR的铰链区为人的CD8α铰链区、跨膜区为人的CD8α跨膜区。4.如权利要求3所述的免疫细胞，其特征在于，所述CAR或者所述TCR识别的抗原为ROR1、GPC3、MSLN或者EpCAM；所述肿瘤抗原识别区为能够结合以上肿瘤抗原的区域，优选scFv；较佳地：识别所述ROR1的scFv的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示，或者，识别所述GPC3的scFv的核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：王征，徐云霞，
申请(专利权)人：苏州康聚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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