一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统技术方案

本发明专利技术属于微生物动物细胞系领域，涉及一种产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统，本发明专利技术利用转座子系统，将两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组整合入HepG2细胞，获得整合有不同拷贝数HBV基因组的克隆株HepG2‑HBV/loxP细胞系，其本身不表达HBsAg，当通过腺病毒转导引入Cre酶后，即生成rcccDNA并表达HBsAg，HBsAg的表达与rcccDNA的产生和水平密切相关；rcccDNA的生成快速且稳定，结构特征与真实HBV cccDNA类似，可以支持病毒的转录、复制和蛋白表达；所述rcccDNA可通过设计特异引物利用定量PCR定量检测，以及利用地高辛标记系统行Southern Blot检测。本发明专利技术建立的细胞系统可用于建立HBV cccDNA相关生物学研究和抗HBV药物的筛选和评价的平台。

A Simple and Efficient Cell System for Producing Recombinant CC Gene of Hepatitis B Virus

The present invention belongs to the field of microbial animal cell lines, and relates to a cell system for producing recombinant hepatitis B virus CC gene. By using transposon subsystem, the single copy genome of HBV with loxP loci at both ends is integrated into HepG2 cells, and a clone HepG2 HBV/loxP cell line with different copies of HBV genome is obtained, which does not express HBsAg itself, and is transferred by adenovirus. After introducing Cre enzyme, rcccDNA is generated and HBsAg is expressed. The expression of HBsAg is closely related to the production and level of rcccDNA. The generation of rcccDNA is fast and stable, and its structural characteristics are similar to that of real HBV ccDNA, which can support the transcription, replication and protein expression of virus. The rcccDNA can be quantitatively detected by quantitative PCR through designing specific primers and using Digoxin Labeling system. Thern Blot detection. The cell system established by the invention can be used to establish a platform for the related biological research of HBV cccDNA and the screening and evaluation of anti-HBV drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统
本专利技术属于微生物动物细胞系领域，涉及一种产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统，具体涉及一种能简单高效产生乙型肝炎病毒(r)cccDNA的细胞系统及其建立方法和用途。
技术介绍
现有技术公开了乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染引起的乙型肝炎是严重危害人类健康的重大传染病。据统计，全球有约20亿人感染或曾经感染HBV，其中2.4亿为慢性乙型肝炎(ChronichepatitisB，CHB)感染患者。据调查显示，慢乙肝患者罹患肝硬化、肝衰竭和肝癌的风险显著增高。虽然近年来慢乙肝的治疗取得了一定的进展，但治疗疗程、耐药及停药后复发等一系列问题仍是目前困扰临床的难题，业内认为，其中一个重要的原因即是HBV特征性的结构分子“共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)”的持续存在和难以清除。研究公开了HBVcccDNA由其前体松弛环状DNA(rcDNA)在宿主DNA聚合酶等的作用下形成，其中rcDNA可来源于新感染的病毒颗粒或病毒复制过程中新合成的病毒核心颗粒。HBVcccDNA在胞核内与病毒Core蛋白、宿主组蛋白及多种调控蛋白形成微小染色体(minichromosome)的结构，可转录生成病毒mRNA，其中前基因组RNA(pregenomicRNA，pgRNA)是病毒蛋白翻译和逆转录复制的模板，因此，只有清除了细胞核内的cccDNA，才有实现完全治愈慢性乙型肝炎的可能；而现有抗病毒药物的作用机制均不直接靶向cccDNA，对肝细胞内cccDNA的影响较为有限。受限于体内体外实验模型的局限，目前对cccDNA的形成、活性调控和降解等生物学特性的认识仍存在若干空白。目前用于研究HBV的体外细胞模型中，人原代肝细胞获得困难，价格昂贵；HepG2.2.15、HepAD38和HepDES19等非感染模型中cccDNA形成均很少甚至没有，在这些模型中，质粒替代cccDNA成为病毒复制的主要模板；而在HepaRG、HepG2/Huh7-NTCP等感染系统中形成的cccDNA仍然很少，难以用Southern印迹杂交(SouthernBlot)检测到信号，并且这些感染细胞模型的培养操作比较复杂耗时，限制了它们在高通量筛选中的应用。近期，中国科学院上海巴斯德研究所邓强课题组报道了一种基于Cre/loxp介导的位点特异性重组诱导生成重组cccDNA(rcccDNA)的策略。基于现有技术的基础，本专利技术拟提供一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统，将用于HBVcccDNA相关生物学特性研究和抗HBV药物，特别是直接靶向于cccDNA的新型药物的筛选评价。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有HBVcccDNA研究模型的不足，建立一种可以简便高效地产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，将用于HBVcccDNA相关生物学特性研究和抗HBV药物的筛选评价。本专利技术结合了转座子和Cre/loxP两个系统，建立了一种新型的HBV(r)cccDNA细胞模型，为HBVcccDNA相关研究和药物筛选特别是直接靶向于cccDNA的新型药物的筛选评价提供了一个高效的平台。本专利技术的目的通过下述技术方案施现：1.采用转座子系统，将两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组整合入HepG2细胞，建立HepG2-HBV/loxP细胞系，共获得包含37株整合有不同拷贝数HBV基因组的克隆株，每个克隆株中整合的HBV基因组拷贝数通过定量PCR进行了定量；2.HepG2-HBV/loxP细胞系本身不表达乙肝表面抗原(HBsAg)；当通过腺病毒载体引入Cre酶后，即可生成重组的HBVrcccDNA并开始表达HBsAg；HBsAg的表达与rcccDNA的产生和水平密切相关。3.HepG2-HBV/loxP细胞系中生成的rcccDNA可通过设计特异引物利用定量PCR进行定量检测；并且可以很容易地利用地高辛标记系统通过SouthernBlot进行检测；4.HepG2-HBV/loxP细胞系中生成的rcccDNA可以很好地支持病毒的生命周期；rcccDNA具有minichromosome结构，并且可以支持病毒的转录、复制和蛋白表达；5.将引入Cre酶的HepG2-HBV/loxP细胞系用于α-干扰素(IFN-α)、阿德福韦酯(Adefovir)和APOBEC3A(A3A)的抗病毒效果评价，可以很好地反映出这三种抗病毒试剂的不同作用机制。本专利技术的实施例中，通过下述方法建立HepG2-HBV/loxP细胞系：①质粒构建：pSBbi-rcccDNA质粒由pSBbi-GP载体质粒(Addgene#60511)插入两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组构建成；pCMV-SB100为Cre重组酶表达质粒(Addgene#34879)；②细胞转染：HepG2细胞以高糖DMEM培养液(BI公司，含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺)培养，将处于生长对数期的细胞，胰酶消化、计数，按1×106细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养过夜，待细胞约80-90％融合成片时用于转染，按照每孔转染2μg的量，将1.8μgpSBbi-rcccDNA与0.2μgpCMV-SB100稀释于100μl纯DMEM培养液中，同时将100μl纯DMEM培养液与12μlPEI转染试剂(Polysciences公司)混合，将稀释后的PEI与质粒混和，室温静置20分钟，将混合物均匀滴加入6孔板中，8小时后更换新鲜培养液，继续培养；③克隆筛选：转染后48小时后，扩大培养至10cm培养皿，待细胞贴壁后加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，每3天换液一次；4周后，嘌呤霉素抗性单克隆形成，共挑取37株单克隆至96孔培养板扩大培养，每4天传一代，以高糖DMEM培养液(BI公司，含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，1μg/ml嘌呤霉素)培养，批量冻存；④检测HBV基因组整合拷贝数：采用北京全式金公司EasyPureGenomicDNAkit(#EE101)抽提基因组DNA，按试剂盒说明书进行操作，定量PCR试剂采用ThunderbirdSYBRqPCRMix(ToYoBo公司，#QPS-201)，扩增仪采用StepOnePlus(ABI公司)，HBV序列以引物5’-ATGACCGAGTACAAGCCCACGGT-3和5’-TTCGAATCAGGCACCGGGCTT-3’进行扩增，同时扩增19号染色体基因组上相同长度序列作为内参。进一步，本专利技术进行了pAd-Cre转导HepG2-HBV/loxP细胞诱导rcccDNA生成实验：其中包括，①构建pAd-Cre重组腺病毒：将Cre重组酶表达序列插入腺病毒载体pAdPLDest构建pAd-Cre质粒，pAd-Cre质粒经PacI内切酶酶切后转染HEK293细胞产生pAd-Cre重组腺病毒；②pAd-Cre转导：HepG2-HBV/loxP细胞以5×106细胞/皿的浓度接种于10cm培养皿，同时加入1×107pAd-Cre重组腺病毒(MOI＝2)进行转导，细胞以含有2％胎牛血清的高糖DMEM培养液进行培养，每2天换一次液；③SouthernBlot检测rc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，通过下述方法建立HepG2‑HBV/loxP细胞系：①质粒构建：pSBbi‑rcccDNA质粒由pSBbi‑GP载体质粒(Addgene#60511)插入两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组构建成；pCMV‑SB100为Cre重组酶表达质粒(Addgene#34879)；②细胞转染：HepG2细胞以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺)培养，将处于生长对数期的细胞，胰酶消化、计数，按1×10

【技术特征摘要】
1.一种产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，通过下述方法建立HepG2-HBV/loxP细胞系：①质粒构建：pSBbi-rcccDNA质粒由pSBbi-GP载体质粒(Addgene#60511)插入两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组构建成；pCMV-SB100为Cre重组酶表达质粒(Addgene#34879)；②细胞转染：HepG2细胞以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺)培养，将处于生长对数期的细胞，胰酶消化、计数，按1×106细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养过夜，待细胞约80-90％融合成片时用于转染，按照每孔转染2μg的量，将1.8μgpSBbi-rcccDNA与0.2μgpCMV-SB100稀释于100μl纯DMEM培养液中，同时将100μl纯DMEM培养液与12μlPEI转染试剂混合，将稀释后的PEI与质粒混和，室温静置20分钟，将混合物均匀滴加入6孔板中，8小时后更换新鲜培养液，继续培养；③克隆筛选：转染后48小时后，扩大培养至10cm培养皿，待细胞贴壁后加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，每3天换液一次；4周后，嘌呤霉素抗性单克隆形成，挑取单克隆至96孔培养板扩大培养，每4天传一代，以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，1μg/ml嘌呤霉素)培养，批量冻存；④检测HBV基因组整合拷贝数：采用EasyPureGenomicDNAkit(#EE101)抽提基因组DNA，定量PCR试剂采用ThunderbirdSYBRqPCRMix，扩增仪采用StepOnePlus，HBV序列以引物5’-ATGACCGAGTACAAGCCCACGGT-3和5’-TTCGAATCAGGCACCGGGCTT-3’进行扩增，同时扩增19号染...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁正宏，邬敏，张小楠，陈捷亮，
申请(专利权)人：复旦大学，上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：上海,31