一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。该方法包括：1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS‑iPSC；2)将所述CS‑iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞。本发明专利技术制备的间充质干细胞或神经干细胞可以作为有效的平台进行高效高通量的个性化药物筛选，为疾病研究、开发疾病模型、研究疾病的发病机制并进行疾病治疗奠定基础。在个性化治疗和转化医学中具有巨大的应用前景。

Preparation of a specific adult stem cell for human Cocaine's syndrome

The invention discloses a preparation method of human Cocaine syndrome specific adult stem cells. The method includes: 1) reprogramming fibroblasts derived from patients with Cocaine's syndrome carrying mutations in specific ERCC6 gene in vitro to obtain induced pluripotent stem cells, designated as CS iPSC; 2) directionally inducing the CS iPSC to differentiate into adult stem cells, i.e., the human Cocaine's syndrome specific adult stem cells. The mesenchymal stem cells or neural stem cells prepared by the invention can be used as an effective platform for high-efficiency and high-throughput personalized drug screening, laying a foundation for disease research, development of disease models, study of disease pathogenesis and disease treatment. It has great application prospects in personalized therapy and transformational medicine.

【技术实现步骤摘要】
一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。
技术介绍
科凯恩氏综合征(Cockaynesyndrome，CS)又称侏儒征、视网膜萎缩和耳聋综合征，或小头、纹状体小脑钙化和白质养分不良综合征。该症由英国医生科凯恩(EdwardAlfredCockayne)于1936年首次发现，是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，发病率约为百万分之2左右。研究显示科凯恩氏综合征发病与ERCC6/CSB、ERCC8/CSA基因突变相关，上述基因的突变致使科凯恩氏综合征病人表现出包括面容苍老、头小、驼背、皮肤对光敏感，皮下脂肪缺失、白内障、视神经萎缩、耳聋等一系列提前衰老的典型症状，患者平均寿命仅12岁。分子机制研究表明，ERCC6、ERCC8主要参与了DNA损伤修复。核苷酸切除修复是紫外(UV)照射产生DNA损伤的最主要修复途径，可分为全基因组修复(globalgenomerepair，GGR)和转录偶联修复(transcription-coupledrepair，TCR)。GGR修复全基因组上的DNA损伤，而TCR只能处于修复转录过程中的DNA损伤。ERCC6-ERCC8复合体主要参与TCR修复通路，ERCC6-ERCC8复合体能够识别DNA损伤位点，并招募下游的蛋白对DNA损伤位点进行切割及修复。大约三分之二的CS病人是ERCC6基因突变。ERCC6基因突变影响DNA损伤的修复，造成基因组的不稳定性，引发病人对紫外的敏感性及紫外诱导的细胞凋亡水平增加。虽然利用模式动物，如小鼠等能够部分再现CS疾病表型，有助于研究CS的发病机制。但由于种属差异较大，人和模式动物的遗传背景不同，因此通过基因敲除等产生的CS小鼠疾病模型并不能真正反映病人的生理状况，如CS病人不产生皮肤癌，而CS小鼠模型会产生严重的皮肤癌。此外，在模式动物中筛选的治疗CS的药物在临床上可能并不适用，不能有效地缓解CS症状。目前对于CS早衰及神经退行的机理研究处于停滞状态，主要原因就是很难获得合适的实验材料。因此，构建人类CS疾病特异的细胞模型将有助于解决这一问题，将为理解CS疾病的细胞表型及分子机制提供线索。近年来，诱导多能干细胞(InducedPluripotentStemCell，iPSC)技术的出现和发展为多种罕见类疾病的基因治疗和细胞治疗提供了广阔前景。iPSC是通过将特定转录因子(如OCT4，SOX2，KLF4，c-MYC等)导入体细胞，使其转变成为具有自我更新及多向分化潜能的干细胞。iPSC衍生的成体干细胞不仅可用于细胞移植，器官再生，还可以构建疾病模型，以便于研究疾病发病机制，筛选新的药物及开发新的治疗方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。第一方面，本专利技术要求保护一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。本专利技术所提供的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，可包括如下步骤：(A1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞(无法正常表达全长ERCC6蛋白)，记为CS-iPSC；(A2)将所述CS-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞(无法正常表达全长ERCC6蛋白)。第二方面，本专利技术要求保护一种经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。本专利技术所提供的经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞，可包括如下步骤：(B1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞(无法正常表达全长ERCC6蛋白)，记为CS-iPSC；(B2)对所述CS-iPSC进行基因编辑，特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变，得到能表达全长ERCC6蛋白的诱导多能干细胞，记为GC-iPSC；(B3)将所述GC-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞(正常表达全长ERCC6蛋白)。其中，所述重编程指不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰(如DNA甲基化)来改变细胞命运的过程。目前重编程主要指两个过程：其一，分化的细胞逆转恢复到全能性状态的过程；其二，从一种分化细胞转化为另一种分化细胞的过程。本专利技术中的重编程主要涉及其一。进一步地，前述第一方面中的步骤(A1)和前述第二方面中的步骤(B1)中，所述重编程均可为将OCT3/4基因、SOX2基因、KLF4基因、L-Myc基因和LIN28基因共同导入(如电转)所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞中，并培养至获得所述CS-iPSC。更进一步地，所述共同导入的方法可包括如下步骤：将表达OCT3/4基因的Episomal载体、表达SOX2基因和KLF4基因的Episomal载体和表达L-Myc基因和LIN28基因的Episomal载体共同导入所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞。所述表达OCT3/4基因的Episomal载体具体为pCXLE-hOCT3/4-shp53-F质粒；所述表达SOX2基因和KLF4基因的Episomal载体为pCXLE-hSK质粒；所述表达L-Myc基因和LIN28基因的Episomal载体为pCXLE-hUL质粒。为了便于阳性克隆的筛选，还可以同时导入含有标记基因的质粒，如pCXLE-EGFP质粒(该质粒携带并表达EGFP基因)。四种质粒的质量配比可为1:1:1:1。所述培养具体可为：先在成纤维细胞培养基中培养1天后换液，用所述成纤维细胞培养基继续培养至第5天后转接到含有预先用丝裂霉素灭活处理过的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层体系中用人类诱导多能干细胞培养基培养至第3周，获得所述CS-iPSC。其中，所述人类诱导多能干细胞培养基的组成如下：基础培养基为DMEM/F12培养基(GIBCO，货号为11330-032)，20％(体积百分含量)Knockout血清替代物(GIBCO，货号为10828-028)，1mMGlutaMAX(Invitrogen，货号为35050-061)，0.1mM非必需氨基酸(GIBCO，货号为11140-050)，55μMβ-巯基乙醇(GIBCO,货号为21985-023)，10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子FGF2(JointProteinCentral，货号为BBI-EXP-002)，加入青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063)，使所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml。所述成纤维细胞培养基的组成如下：基础培养基为DMEM培养基(HyClone，货号为SH30243.01)，10％(体积百分含量)胎牛血清(Gemcell，货号为100-500)，加入青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063)，使所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml。在本专利技术中，前述第一方面和第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，包括如下步骤：(A1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS‑iPSC；(A2)将所述CS‑iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，包括如下步骤：(A1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS-iPSC；(A2)将所述CS-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞。2.一种经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，包括如下步骤：(B1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS-iPSC；(B2)对所述CS-iPSC进行基因编辑，特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变，得到能表达全长ERCC6蛋白的诱导多能干细胞，记为GC-iPSC；(B3)将所述GC-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：权利要求1的步骤(A1)和权利要求2的步骤(B1)中，所述重编程均为将OCT3/4基因、SOX2基因、KLF4基因、L-Myc基因和LIN28基因共同导入所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞中，并培养至获得所述CS-iPSC；和/或所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变为c.643G>T和/或c.3776C>A；和/或权利要求2的步骤(B2)中，所述“特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变”为将所述c.643G>T矫正为c.643G>G，和/或将所述c.3776C>A矫正为c.3776C>C。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述成纤维细胞为皮肤成纤维细胞；和/或所述成体干细胞为间充质干细胞或神经干细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：当所述成体干细胞为间充质干细胞时，权利要求1的步骤(A2)和权利要求2的步骤(B3)中，是按照包括如下步骤的方法将所述CS-iPSC或所述GC-iPSC定向诱导分化为间充质干细胞的：(a1)将所述CS-iPSC或所述GC-iPSC进行拟胚体分化，获得拟胚体；(a2)为如下(a2-1)或(a2-2)：(a2-1)将所述拟胚体接种于基质胶包被的培养板中进行培养，得到纤维状细胞，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即得所述间充质干细胞；(a2-2)将所述拟胚体接种于玻璃粘连蛋白包被的培养板中进行培养，得到纤维状细胞，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即得所述间充质干细胞；当所述成体干细胞为神经干细胞时，权利要求1的步骤(A2)和权利要求2的步骤(B3)中，是按照包括如下步骤的方法将所述CS-iPSC或所述GC-iPSC定向诱导分化为神经干细胞的：(b1)在人类诱导多能干细胞培养基中对所述CS-iPSC或所述GC-iPSC进行诱导培养，得到诱导培养后细胞；(b2)在神经干细胞诱导培养基1中对所述诱导培养后细胞进行第一次分化培养，得到第一次分化培养后细胞；(b3)在神经干细胞诱导培养基2中对所述第一次分化培养后细胞进行第二次分化培养，得到所述神经干细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在(a2-1)中，所述培养是在间充质干细胞培养基1中进行的；所述间充质干细胞培养基1为在αMEM培养基中加入胎牛血清、青霉素/链霉素、重组人成纤维细胞生长因子FGF2和TGFβ后得到的培养基；其中，所述胎牛血清在所述间充质干细胞培养基1中的体积百分含量为10％；所述青霉素在所述间充质干细胞培养基1中的终浓度为10000Units/ml，链霉素在所述间充质干细胞培养基1中的终浓度为10000μg/ml；所述重组人成纤维细胞生长因子FGF2在所述间充质干细胞培养基1中的含量为10ng/ml；所述TGFβ在所述间充质干细胞培养基1中的含量为5ng/ml；和/或在(a2-2)中，所述培养是在间充质干细胞培养基2中进行的；所述间充质干细胞培养基2为在MSC基础培养基中加入血清替代物、TGFβ、重组人成纤维细胞生长因子FGF2、EGF、PDGF、青霉素/链霉素后得到的培养基；其中，所述血清替代物在所述间充质干细胞培养基2中的体积百分含量为5％；所述青霉素在所述间充质干细胞培养基2中的终浓度为10000Units/ml，链霉素在所述间充质干细胞培养基2中的终浓度为10000μg/ml；所述重组人成纤维细胞生长因子FGF2在所述间充质干细胞培养基2中的含量为6ng/ml；所述TGFβ在所述间充质干细胞培养基2中的含量为5ng/ml；所述EGF在所述间充质干细胞培养基2中的含量为10ng/ml；所述PDGF在所述间充质干细胞培养基2中的含量为10ng/ml；和/或所述神经干细胞诱导培养基2由AdvancedDMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、N2、B27、GlutaMAX、人白血病抑制因子hLIF、CHIR99021、SB431542和CompoundE混合而成；所述AdvancedDMEM/F12培养基在所述神经干细胞诱导培养基2中的体积分数为48.5％；所述Neurobasal培养基在所述神经干细胞诱导培养基2中的体积分数为48.5％；所述N2在所述神经干细胞诱导培养基2中的体积分数为1％；所述B27在所述神经...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光慧，乔杰，曲静，于洋，王思，耿令令，闵喆莹，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11