用于评价抗TNF-α药物生物学活性的重组细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于评价抗TNF‑α药物生物学活性的重组细胞及其应用。用于检测肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性的重组HT1080细胞，所述的重组HT1080细胞是在HT1080细胞上建立一个带有分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的报告基因系统，碱性磷酸酶或荧光素酶报告基因与NF‑kB的启动子相连来驱动分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的表达分泌。本发明专利技术重组细胞可用于评价抗TNF‑α类药物的生物学活性，肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性，以及抗肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的药物的生物学活性，具有灵敏的，简单可靠的优点。

Recombinant Cells for Evaluating the Biological Activity of Anti-TNF-alpha Drugs and Their Application

The present invention discloses recombinant cells for evaluating the biological activity of anti-TNF_alpha drugs and their applications. The recombinant HT1080 cells are used to detect the biological activity of the interaction between tumor necrosis factor receptor and its ligand. The recombinant HT1080 cells are constructed on HT1080 cells to establish a reporter gene system with secretory alkaline phosphatase or luciferase. The alkaline phosphatase or luciferase reporter gene is linked to the promoter of NF kB to drive secretory alkaline phosphatase or luciferase. The expression and secretion of enzymes. The recombinant cells of the present invention can be used to evaluate the biological activities of anti-TNF_alpha drugs, the interaction between the tumor necrosis factor receptor and its ligand, and the interaction between the anti-tumor necrosis factor receptor and its ligand. The recombinant cells have the advantages of sensitivity, simplicity and reliability.

【技术实现步骤摘要】
用于评价抗TNF-α药物生物学活性的重组细胞及其应用
本专利技术属于生物医药领域,涉及用于评价抗TNF-α药物生物学活性的重组细胞及其应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF)和与之相对应的同源肿瘤坏死因子受体超级家族对维持免疫稳态及对不同的免疫反应采取正确的行动起到关键的作用。肿瘤坏死因子及其受体在免疫系统中参与多层次的调控作用，它们既能发现有潜在危险的或者多余的细胞，选择性诱导这些细胞死亡，又能提供共刺激信号来帮助建立有效免疫反应。这种对免疫的多样性调控在肿瘤免疫治疗药物的研究中取得重要的进展。肿瘤坏死因子受体超级家族介导的对肿瘤坏死因子的生理反应是用于治疗许多慢性炎症靶点的重要手段之一。肿瘤坏死因子受体(TNFR)超级家族是属于细胞因子受体的一类蛋白超级家族，其特征在于其细胞膜外富含半胱氨酸的结构域能与肿瘤坏死因子结合。这些肿瘤坏死因子受体通常在细胞膜上表达为三聚体I型跨膜蛋白，在其胞外区有一至六个富含半胱氨酸的结构域。肿瘤坏死因子受体超级家族一共有27个家族成员，其中，TNFR1和TNFR2是最为重要的成员。对应于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超级家族，肿瘤坏死因子(TNF)超级家族也有27个配体，它们都共有一个保守的羧基末端同源结构域，称之为TNF同源结构域(THD)。THD促进肿瘤坏死因子形成同源三聚体分子，在极少数情况下，肿瘤坏死因子会形成二聚体或异源三聚体，THD对TNF与TNFR相互作用是非常重要的。肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子受体结合后的信号传导是复杂和多样化的，但最主要的是诱导细胞死亡，提供共刺激信号，或刺激细胞活化。TNF和TNFR诱导的细胞死亡信号通过TNFR1进行，这个过程需要释放细胞内TNFR抑制剂，死亡域沉默(SODD)蛋白，TNF与TNFR1的相互作用诱导了胱天蛋白酶依赖性凋亡细胞死亡。肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的几个成员(CD27，4-1BB(CD137)，OX40(CD134)，HVEM，CD30和GITR)在初始T细胞活化后能够维持T细胞的反应，这些共刺激TNFR家族成员的作用在功能上，时间上或空间上与CD28的作用是相互独立的，它们本身之间的作用在功能上，时间上或空间上也是相互独立的。与之肿瘤坏死因子名字的意义相反，TNF和TNFR信号通常不会杀死细胞，而是导致NF-κB或几个额外的非死亡信号通路的激活，TNF和TNFR信号不仅导致NF-κB的激活，而且激活了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和氨基末端激酶(JNK)相关的信号通路。TNF诱导的NF-κB的激活在炎症中起重要的作用，NF-κB是众多促炎症因子，趋化因子，及其受体的广谱的反式激活剂。HT1080是一种广泛用于生物医学研究的纤维肉瘤细胞系，HT1080对TNF家族的所有死亡诱导配体导致的细胞凋亡有反应，HT1080细胞膜上有内源性的TNF-α受体的表达。虽然TNF-α一方面导致HT1080的凋亡，另一方面它又通过激活HT1080中的NF-κB的信号来抑制TNF-α对HT1080的凋亡作用，细胞死亡与否是由这二种机制的互相均衡决定的，NF-κB调节许多生物学重要基因的表达，如编码炎性细胞因子，干扰素，生长因子，细胞粘附分子和病毒的基因，HT1080细胞NF-κB的信号的强弱可以用分泌性碱性磷酸酶(SEAP)或荧光素酶的报告基因来检测，同时，TNF-α还会刺激HΤ1080分泌白介素8(IL-8)。基于上面所描述的肿瘤坏死因子的重要作用，它们成为药物研发的非常重要的靶点，包含了癌症免疫治疗药物研发，炎症和自身免疫性疾病，心血管疾病，纤维化疾病和掌腱膜挛缩。目前市场上有五个肿瘤坏死因子靶向的生物类药被批准，它们用于治疗类风湿关节炎，炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性溃疡结肠炎)，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，幼年特发性关节炎，强直性脊柱炎，以及化脓性紫癜。有一个能够客观的衡量肿瘤坏死因子功能的体外活性的方法显得更为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供用于检测肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性的重组HT1080细胞。本专利技术的另一目的是提供该重组HT1080细胞的应用。本专利技术的又一目的是提供评价抗TNF-α药物或肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用或抗肿瘤坏死因子受体类药物与其配体类药物的相互作用的生物学活性的方法。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：用于检测肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性的重组HT1080细胞，所述的重组HT1080细胞是在HT1080细胞上建立一个带有分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的报告基因系统，碱性磷酸酶或荧光素酶报告基因与NF-κB的启动子相连来驱动分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的表达分泌；或者在上述建立的HT1080/荧光素酶的报告基因细胞上，转染一个外源性TNF受体，使细胞上稳定表达一个外源性TNF受体，构建得到HT1080/荧光素酶报告基因/人TNF受体稳定细胞。所述的重组HT1080细胞优选，所述的分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶报告基因与一个带有5个重复NF-κB结合序列，一个ELAM启动子相连，形成NF-κB(5x)-ELAM-SEAP/Luciferase序列；将该序列插入慢病毒载体中替换掉原有启动子；使用第四代病毒包装系统(Clontech的Lenti-XTMPackagingSingleShots(VSV-G))获得慢病毒并转染HT1080细胞，最后通过抗生素抗性及报告基因表达量筛选，抗生素抗性及报告基因表达量最高的细胞株即为所述的重组HT1080细胞。作为所述的重组HT1080细胞的另一种优选，还可通过向所述的表达荧光素酶Luciferase报告基因的HT1080细胞转染一个外源性TNF受体BCMA，使细胞上稳定表达一个外源性BCMA，得到HT1080/荧光素酶报告基因/人BCMA稳定细胞。本专利技术所述的重组HT1080细胞的构建方法，包括以下步骤：(1)全基因合成5个重复NF-κB结合序列，一个ELAM启动子，一个分泌型碱性磷酸酶SEAP或一个荧光素酶Luciferase报告基因组成的NF-κB(5x)-ELAM-SEAP序列或NF-κB(5x)-ELAM-Luciferase序列；将该序列插入慢病毒载体中，将原有的CMV启动子替换，得到带有相应抗生素抗性的NF-κB(5x)-ELAM-SEAP/NF-κB(5x)-ELAM-Luciferase的plvx载体；(2)采用第四代病毒包装系统(Clontech的Lenti-XTMPackagingSingleShots(VSV-G))，使用聚乙烯亚胺PEI转染法共转染293T细胞，进行慢病毒的包装；(3)慢病毒转染HT1080细胞，通过相应抗生素抗性及分泌型碱性磷酸酶SEAP或荧光素酶Luciferase表达量筛选，相应抗生素抗性及报告基因表达量最高的细胞株即为所述的重组HT1080细胞；或者，在上述构建表达荧光素酶Luciferase的重组HT1080细胞的基础上，还包含以下步骤：(4)合成上游带有BstBI酶切位点、下游带有BamHI酶切位点的人BCMA的DNA序列，通过酶切插入带有puromycin抗性的plvx-puro质粒中，得到plvx-BCMA-puro载体；(5)采用第四代本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性的重组HT1080细胞，其特征在于：所述的重组HT1080细胞是在HT1080细胞上建立一个带有分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的报告基因系统，碱性磷酸酶或荧光素酶报告基因与NF‑κB的启动子相连来驱动分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的表达分泌；或者在上述建立的HT1080/荧光素酶的报告基因细胞上，转染一个外源性TNF受体，使细胞上稳定表达一个外源性TNF受体，构建得到HT1080/荧光素酶报告基因/人TNF受体稳定细胞。

【技术特征摘要】
1.用于检测肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性的重组HT1080细胞，其特征在于：所述的重组HT1080细胞是在HT1080细胞上建立一个带有分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的报告基因系统，碱性磷酸酶或荧光素酶报告基因与NF-κB的启动子相连来驱动分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的表达分泌；或者在上述建立的HT1080/荧光素酶的报告基因细胞上，转染一个外源性TNF受体，使细胞上稳定表达一个外源性TNF受体，构建得到HT1080/荧光素酶报告基因/人TNF受体稳定细胞。2.根据权利要求1所述的重组HT1080细胞，其特征在于所述的分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶报告基因与一个带有5个重复NF-κB结合序列，一个ELAM启动子相连，形成NF-κB(5x)-ELAM-SEAP/Luciferase序列；将该序列插入慢病毒载体中替换掉原有启动子；使用第四代病毒包装系统获得慢病毒并转染HT1080细胞，最后通过抗生素抗性及报告基因表达量筛选抗生素抗性及报告基因表达量最高的细胞株即为所述的重组HT1080细胞。3.根据权利要求1所述的重组HT1080细胞，其特征在于所述的重组HT1080细胞还可通过向权利要求2中所述的表达荧光素酶Luciferase报告基因的HT1080细胞转染一个外源性TNF受体BCMA，使细胞上稳定表达一个外源性BCMA，得到HT1080/荧光素酶报告基因/人BCMA稳定细胞。4.权利要求1-3中任一项所述的重组HT1080细胞的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)全基因合成5个重复NF-κB结合序列，一个ELAM启动子，一个分泌型碱性磷酸酶SEAP或一个荧光素酶Luciferase报告基因组成的NF-κB(5x)-ELAM-SEAP序列或NF-κB(5x)-ELAM-Luciferase序列；将该序列插入慢病毒载体中，将原有的CMV启动子替换，得到带有相应抗生素抗性的NF-κB(5x)-ELAM-SEAP/NF-κB(5x)-ELAM-Luciferase的plvx载体；(2)采用第四代病毒包装系统，使用聚乙烯亚胺PEI转染法共转染293T细胞，进行慢病毒的包装；(3)慢病毒转染HT1080细胞，通过相应抗生素抗性及分泌型碱性磷酸酶SEAP或荧光素酶Luciferase表达量筛选相应抗生素抗性及报告基因表达量最高的细胞株即为所述的重组HT1080细胞；或者，在上述构建表达荧光素酶Luciferase的重组HT1080细胞的基础上，还包含以下步骤：(4)合成上游带有BstBI酶切位点、下游带有BamHI酶切位点的人BCMA的DNA序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋忻坡，张辉辉，彭园园，詹泰岚，蒋坤，李苏蓉，徐飞，李凤霞，
申请(专利权)人：南京传奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32