通用性Treg细胞的培养液及其培养方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种通用性Treg细胞的培养液及其培养方法与应用，通用性Treg细胞的培养液的培养方法包括以下步骤：S110：将CD4+CD25+Treg细胞和hUC‑MSCs按照一定比例共同培养48h‑72h，离心取上清液；S220：制备外周血PBMC及血浆，将所述血浆灭活，离心待用；S330：向S110获得的上清液中加入细胞因子、钙离子载体、S220所得的血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液；S440：将外周血PBMC按照一定的密度接种于S330配制的Treg细胞培养液中，培养48h‑96h；S550：收集细胞，细胞活率大于90%，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%。解决了Treg细胞培养操作复杂和周期过长的问题，解决了外周血CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞的含量过低和因自体疾病问题导致自体Treg细胞质量低下的患者而不能进行Treg细胞治疗的问题。

【技术实现步骤摘要】
通用性Treg细胞的培养液及其培养方法与应用
本专利技术涉及细胞
，特别是涉及通用性Treg细胞的培养液及其培养方法与应用。
技术介绍
调节性T细胞(Treg)是近年来新发现的一群表型和功能特异的T细胞亚群，对免疫反应具有抑制效应，从而在肿瘤免疫、移植物耐受、自体免疫性疾病及机体自体免疫平衡方面均有重要作用。Treg细胞对人体的免疫系统和内分泌系统来说是把双刃剑。它对维持机体免疫耐受和免疫应答稳态具有非常重要的作用，可以通过一系列机制抑制过强的免疫应答，使得机体在自体损伤最小的情况下有效的清除抗原或病原体。控制Treg细胞的数量与表达可以帮助我们控制疾病的进程。Treg细胞主要通过两种方式发挥免疫抑制功能。第一种方式是Treg细胞可以通过分泌异质性细胞因子等发挥免疫调节作用；第二种方式是Treg细胞主要通过细胞与细胞的直接接触来发挥作用。CD4+CD25+Treg细胞作为一类调节性T细胞，在自体反应性T细胞的增殖，维持免疫耐受方面起着重要的作用。现有技术中采用免疫磁珠两步法分离CD4+CD25+Treg细胞，并用CD4+CD25+Treg细胞专用的完全培养基和一定浓度的IL-2培养扩增CD4+CD25+Treg细胞。在上述现有技术中使用的培养基成本较高，免疫磁珠分选CD4+CD25+Treg细胞需要过柱，操作繁琐，且上述培养周期较长。因此，如何简单分离培养和缩短CD4+CD25+Treg细胞的培养周期是当下研究的方向之一。CD4+CD25+Treg细胞可分为自然性Treg细胞（nTreg细胞）和诱导性Treg细胞（iTreg细胞）两部分。目前认为CD4+CD25+Foxp3+为Treg细胞的特征性表型。研究表明在青年人、正常老年人、老年肿瘤及疾病患者的外周血淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例逐渐升高；但相反，外周血CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞的比例依次降低。因此如何提高外周血CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞的表达量是发挥Treg细胞的免疫调节作用的关键。目前用于疾病治疗研究的Treg细胞多采用患者自体外周血进行分离培养，但对于那些因自体疾病问题导致自体Treg细胞质量低下的患者而言是不能进行Treg细胞治疗，因此研发无抗原性的通用性Treg细胞是解决这一问题的关键。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述的问题，提供一种通用性Treg细胞的培养液的培养方法。一种通用性Treg细胞的培养液的培养方法，包括以下步骤：S110：将CD4+CD25+Treg细胞和hUC-MSCs按照一定比例密度共同培养48-72h，然后离心取上清液；S220：制备外周血PBMC及血浆，将所述血浆灭活，离心待用；S330：向S110获得的上清液中加入一种或多种细胞因子、钙离子载体、S220所得的血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液；S440：将外周血PBMC按照一定的密度接种于S330配制的Treg细胞培养液中，培养48-96h；S550：收集细胞，细胞活率大于90%，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%。上述一种通用性Treg细胞的培养液的培养方法，本专利技术通过将P3代hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg共同培养后收集共培养液的上清液，添加细胞因子、钙离子载体、血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液，接种单个核细胞，培养48h以上获得的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%，解决了Treg细胞培养操作复杂和周期过长及CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞的含量过低的问题；通过添加P3代hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg共同共培养液的上清液使得培养的Treg细胞具有低抗原性，其通用性解决了因自体疾病问题导致自体Treg细胞质量低下的患者而不能进行Treg细胞治疗的问题。在其中一个实施例中，CD4+CD25+Treg细胞与hUC-MSCs的比例密度为：CD4+CD25+Treg细胞的密度为1×106-2×106cells/ml，hUC-MSCs的密度为1×105-2×105cells/ml。在其中一个实施例中，CD4+CD25+Treg细胞是采用EasySepTM人CD4+CD25+T细胞分选试剂盒自外周血PBMC中分选制得。在其中一个实施例中，hUC-MSCs通过以下方法制备：去除脐带中的动静脉和羊膜；取华通氏胶，剪成的碎块，较优地，剪成成2mm3左右的碎块；用含5-20ng/mlEGF-β的X-VIVO15无血清培养基培养原代hUC-MSCs，培养24h后换液，去除未贴壁的细胞；培养至hUC-MSCs汇合度达到90％，用0.25m/v％胰蛋白酶消化3min，1000rpm离心得到P1代hUC-MSCs；继续传代培养至获得P3代hUC-MSCs。在其中一个实施例中，外周血PBMC通过以下方法制备：取25-24岁健康人的外周血PBMC，离心处理收集淋巴细胞层。在其中一个实施例中，血浆通过以下方法制备：取25-24岁健康人的外周血PBMC，离心处理收集淋巴细胞层，获得外周血PBMC的分离液，收集所述外周血PBMC的分离液的上层血浆，将血浆置于50-60℃灭活20-40min，离心后的即得血浆。在其中一个实施例中，步骤S440中外周血PBMC的密度为1×106-2×106cells/ml。在其中一个实施例中，细胞因子选自白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或几种。在其中一个实施例中，钙离子载体为A23187。本专利技术还提供了上述培养方法制成的通用性Treg细胞的培养液，该通用性Treg细胞的培养液包括以下组分：CD4+CD25+Treg细胞及hUC-MSCs的上清液与RPMI1640培养液的混合液、外周血PBMC的血浆、钙离子载体、细胞因子；所述细胞因子选自白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或几种。在其中一个实施例中，CD4+CD25+Treg细胞及hUC-MSCs共培养的上清液与RPMI1640培养液的体积比为2:1-1:1。在其中一个实施例中，外周血PBMC的血浆于所述通用性Treg细胞的培养液中的体积浓度为5%-10%。在其中一个实施例中，所述钙离子载体的浓度为50-120ng/ml。在其中一个实施例中，白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的含量分别为：白细胞介素-2（IL-2）的浓度为500-800IU/ml、白细胞介素-12（IL-12）的浓度为100-200ng/ml、类胰岛素一号增长因子（IGF-1）的浓度为200-350ng/ml、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的浓度为200-400IU/ml。上述任一项所述的通用性Treg细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通用性Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S110：将CD4+CD25+Treg细胞和 hUC‑MSCs按照一定比例密度共同培养48‑72h，然后离心取上清液；S220：制备外周血PBMC及血浆，将所述血浆灭活，离心待用；S330：向S110获得的上清液中加入细胞因子、钙离子载体、S220所得的血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液；S440：将外周血PBMC按照一定的密度接种于S330配制的Treg细胞培养液中，培养48h‑96h；S550：收集细胞，细胞活率大于90%，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%。

【技术特征摘要】
1.一种通用性Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S110：将CD4+CD25+Treg细胞和hUC-MSCs按照一定比例密度共同培养48-72h，然后离心取上清液；S220：制备外周血PBMC及血浆，将所述血浆灭活，离心待用；S330：向S110获得的上清液中加入细胞因子、钙离子载体、S220所得的血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液；S440：将外周血PBMC按照一定的密度接种于S330配制的Treg细胞培养液中，培养48h-96h；S550：收集细胞，细胞活率大于90%，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%。2.根据权利要求1所述的通用性Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述CD4+CD25+Treg细胞与hUC-MSCs的比例密度为：CD4+CD25+Treg细胞的密度为1×106-2×106cells/ml，hUC-MSCs的密度为1×105-2×105cells/ml。3.根据权利要求1所述的通用性Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述CD4+CD25+Treg细胞是采用EasySepTM人CD4+CD25+T细胞分选试剂盒自外周血PBMC中分选制得。4.根据权利要求1所述的通用性Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述hUC-MSCs通过以下方法制备：去除脐带中的动静脉和羊膜；取华通氏胶，剪成碎块；用含5-20ng/mlEGF-β的X-VIVO15无血清培养基培养原代hUC-MSCs，培养24h后换液，去除未贴壁的细胞；培养至hUC-MSCs汇合度达到90％，用0.25m/v％胰蛋白酶消化3min，1000rpm离心得到P1代hUC-MSCs；继续传代培养至获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢海涛，郭东升，王乃会，姚余卫，
申请(专利权)人：广东先康达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44