一种加载PD-1抗体的T细胞体外培养方法、其细胞制剂及其应用技术

本发明专利技术实施例公开了一种加载PD‑1抗体的T细胞体外培养方法、其细胞制剂及其应用，涉及免疫治疗技术领域，具体而言，该培养方法包括以下步骤：其包括将外周血单个核细胞与A抗培养基混合进行第一次培养；然后，将第一次培养得到的产物与B型培养基混合进行第二次培养；最后，将第二次培养后得到的产物与K型培养基混合。该培养方法能够诱导全血分离出的淋巴细胞在培养过程中向CD8+T细胞增值分化，分离出的T细胞能够在18天以内达到40倍以上的增幅，且CD8+T细胞的占比超过80％。

【技术实现步骤摘要】
一种加载PD-1抗体的T细胞体外培养方法、其细胞制剂及其应用
本专利技术涉及免疫治疗
，具体而言，涉及一种加载PD-1抗体的T细胞体外培养方法、其细胞制剂及其应用。
技术介绍
当今癌症还是未能攻克疾病难题，2013年免疫疗法被“科学”杂志誉为最有可能治愈癌症的方法。免疫细胞治疗是免疫疗法中的重点部分，免疫细胞治疗从上个世纪70年代开始，最早的是LAK细胞(从人体抽取外周血，体外从外周血分离出淋巴细胞，加入大剂量的白介素-2进行体外培养增殖然后获得增殖数倍的淋巴细胞命名为LAK细胞，然后把培养完成的LAK细胞做成细胞悬液的制剂静脉输注人体)，LAK细胞是最早的免疫细胞体外培养后应用于癌症治疗的免疫细胞体外培养技术。到2000年左右，新一代免疫细胞—CIK细胞应用于临床癌症治疗，其较LAK细胞体外培养技术主要是不以大剂量白介素-2刺激细胞，采用CD3单抗和多种细胞因子(白介素-2、加码-干扰素等)，但CIK细胞增值倍数低，杀伤性T细胞比例低，再针对癌症使用时疗效不明显，其培养技术上是完全培养基上添加CD3单抗激活细胞增殖，然后后续培养添加白介素-2维持细胞增殖，这样培养只能使混杂一起各种细胞都增殖，故培养完成的最主要CD8+细胞占比不高(50％左右)，由于混杂细胞存在一起各种细胞分泌不同细胞因子互相影响导致CD8+T细胞的杀伤性(细胞毒性)不强也就输注癌症病人体内所起治疗作用(对抗癌细胞作用)也不强。之后DC细胞发现并且应用于体外培养，并且DC细胞与CIK细胞共培养而成的DC-CIK细胞，在技术上是使DC细胞提呈抗原作用刺激CIK细胞使CIK细胞更好增殖倍数和细胞功能。因此，临床疗效优于CIK细胞，但CD8+T细胞的杀伤性(细胞毒性)同样不强。2017年，CAR-T细胞在美国获批上市，CAR-T细胞是抽取病人外周血体外分离出淋巴细胞，然后培养并使其向CD8+T细胞分化并获得一定数量，然后使用腺病毒作载体把CD19的识别基因嵌入该细胞DNA而获得嵌入特异抗原受体的T细胞命名为CAR-T细胞，该CAR-T细胞能特异识别某种类型的B细胞白血病，从而特异性攻击这种B细胞白血病的癌变细胞，把癌变细胞破坏而治疗这种白血病，并且有成功治愈个案。2017年，PD-1抗体作为治疗癌症药物获批上市，有两家国家医药公司获得一是默沙东的K，另一是施贵宝的O药，该药物上市引起轰动，有效率最高达40％(化疗药、靶向药等癌症药物的有效率很高才百分之十几)被誉为抗癌神药。但是，PD-1抗体能疗效只能针对一部分患者，是由于肿瘤产生了PD-L1，对于其他由于肿瘤不是由于PD-L1原因造成的，要么PD-1抗体药物是没有任何作用的，并且PD-1抗体药物具有很大的毒副作用。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种T细胞的培养方法，该培养方法能够诱导全血分离出的淋巴细胞在培养过程中向CD8+T细胞增值分化，从而制备得到的杀伤性T细胞，且分离出的T细胞能够在18天以内达到40倍以上的增幅，且CD8+T细胞的占比超过80％。本专利技术的第二目的在于提供一种T细胞的培养基组合，该培养基组合能够有效在短期内培养出具有大量具有杀伤力的T细胞。本专利技术的第三目的在于提供一种T细胞(称为PD-1-T细胞，在培养后期加入PD-1抗体，使T细胞上的PD-1分子被PD-1抗体结合而封闭，称为PD-1-T细胞)，该T细胞具有较高的分泌细胞因子的功能，对于肿瘤细胞攻击性较强，且不受肿瘤细胞的PD-L1影响，具有能够广谱抗癌的优点。本专利技术的第四目的在于提供一种细胞制剂，其包括有上述杀伤性较强的T细胞，具有比DC-CIK细胞更好的抗癌疗效。本专利技术的第五目的在于提供上述杀伤性T细胞或细胞制剂在细胞制剂在制备抗癌药物中的应用。本专利技术是这样实现的：本专利技术实施例提供了一种T细胞的培养方法，其包括以下步骤：对外周血单个核细胞进行培养，并在培养后期向培养液中添加PD-1抗体继续培养。需要说明的是，PD-1抗体药物是这样起作用的：免疫细胞中的T细胞上(膜上)表达PD-1，而肿瘤细胞上(膜上)表达或分泌出(外泌体)PD-L1,然而PD-L1是PD-1配体，他们结合能使这个T细胞便进入程序死亡并失去功能，所以科学家发现肿瘤细胞因有PD-L1而逃逸T细胞追杀，那么使用PD-1抗体把T细胞上PD-1分子封闭，肿瘤细胞上的PD-L1就不能触动T细胞上的PD-1，这样T细胞到肿瘤组织中也不会被PD-L1接触而死亡反可执行清除癌细胞功能杀死癌细胞。由PD-1抗体药物作用原理可见，PD-1抗体药物是没有直接杀死癌细胞作用的，它仅仅是保护了身体里面的T细胞，起到杀死癌细胞作用的还是T细胞。但肿瘤产生PD-L1只是其中一种原因，如果是这个原因使用PD-1抗体药物必然很好疗效，美国前总统得了黑色素瘤使用PD-1抗体药物后痊愈了，肿瘤消失。但如果肿瘤产生不是PD-L1原因造成的，那么使用PD-1抗体药物是没有任何作用的，而且PD-1抗体药物有很大毒副作用。人体或动物的免疫系统，能清除变异的细胞(癌细胞)、衰老、坏死细胞，因而使机体保持健康，而免疫系统执行免疫功能的就是各种的免疫细胞(白细胞)，其中，淋巴细胞是主要起到清除癌变细胞作用，淋巴细胞中T细胞，特别是CD8+T细胞是最重要执行清除功能的免疫细胞。本专利技术将T细胞本身作为治疗物质，加入PD-1抗体作为封闭T细胞膜上的PD-1分子，而非将PD-1抗体作为抗体药物本身，同时，本专利技术实施例提供的培养方法加强了T细胞本身的杀伤力，能够有效避免了T细胞因为肿瘤细胞上可能存在的PD-L1而丧失功能以及PD-L1对使用者的副作用。优选地，该培养包括包括将外周血单个核细胞与A抗培养基混合进行第一次培养；然后，将第一次培养得到的产物与B型培养基混合进行第二次培养；最后，将第二次培养后得到的产物与K型培养基混合进行第三次培养。所述A抗培养基包括有完全培养基、CD3单抗以及以下一种或多种组分：白介素-2、维生素B6、干扰素-γ、白介素-1b、白介素-4、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；所述K型培养基包括有完全培养基、PD-1抗体以及以下一种或多种组分：白介素-2、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；所述B型培养基中包括有完全培养基、CD28抗体以及以下一种或多种组分：白介素-2、维生素C、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白。进一步地，在A抗培养基中，CD3单抗的终浓度为80～120ng/ml；优选地，在A抗培养基中，白介素-2的终浓度为800～1200u/ml，维生素B6的终浓度为5～15ng/ml，干扰素-γ的终浓度为15～25ng/ml，白介素-1b的终浓度为5～15ng/ml，白介素-4的终浓度为5～15ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为180～220ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为15～25ng/ml，血浆蛋白的终浓度为40～60ng/ml。需要说明的是，在A抗培养基中，CD3单抗能够激活白细胞膜上CD3分子，使白细胞向T细胞分化，白介素-2能够激动白细胞分化增殖；维生素B6能够强化白细胞氨基酸利用，激活细胞蛋白质合成从而强化细胞功能；干扰素-γ能够使白细胞向CD8+T细胞分化；白介素-1b能够激活分离后单个核细胞中含有微量的DC细胞，让DC细胞分泌IL-12使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T细胞的培养方法，其特征在于，包括：对外周血单个核细胞进行培养，并在培养后期向培养液中添加PD‑1抗体继续培养；其优选地，所述培养方法包括以下步骤：其包括将外周血单个核细胞与A抗培养基混合进行第一次培养；然后，将第一次培养得到的产物与B型培养基混合进行第二次培养；最后，将第二次培养后得到的产物与K型培养基混合进行第三次培养；所述A抗培养基包括有完全培养基、CD3单抗以及以下一种或多种组分：白介素‑2、维生素B6、干扰素‑γ、白介素‑1b、白介素‑4、L‑谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；所述K型培养基包括有完全培养基、PD‑1抗体以及以下一种或多种组分：白介素‑2、L‑谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；所述B型培养基中包括有完全培养基、CD28抗体以及以下一种或多种组分：白介素‑2、维生素C、L‑谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种T细胞的培养方法，其特征在于，包括：对外周血单个核细胞进行培养，并在培养后期向培养液中添加PD-1抗体继续培养；其优选地，所述培养方法包括以下步骤：其包括将外周血单个核细胞与A抗培养基混合进行第一次培养；然后，将第一次培养得到的产物与B型培养基混合进行第二次培养；最后，将第二次培养后得到的产物与K型培养基混合进行第三次培养；所述A抗培养基包括有完全培养基、CD3单抗以及以下一种或多种组分：白介素-2、维生素B6、干扰素-γ、白介素-1b、白介素-4、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；所述K型培养基包括有完全培养基、PD-1抗体以及以下一种或多种组分：白介素-2、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；所述B型培养基中包括有完全培养基、CD28抗体以及以下一种或多种组分：白介素-2、维生素C、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在A抗培养基中，CD3单抗的终浓度为80～120ng/ml；优选地，在A抗培养基中，白介素-2的终浓度为800～1200u/ml，维生素B6的终浓度为5～15ng/ml，干扰素-γ的终浓度为15～25ng/ml，白介素-1b的终浓度为5～15ng/ml，白介素-4的终浓度为5～1ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为180～220ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为15～25ng/ml，血浆蛋白的终浓度为40～60ng/ml；在B型培养基中，CD28抗体5～15ng/ml；优选地，在B型培养基中，白介素-2的终浓度为1800～2200u/ml，维生素B6的终浓度为5～15ng/ml，维生素C的终浓度为5～15ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为80～120ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为5～15ng/ml，血浆蛋白的终浓度为15～25ng/ml；在K型培养基中，PD-1抗体的终浓度为5～15ng/ml；优选地，在K型培养基中，白介素-2的终浓度为1800～2200u/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为40～60ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为3～8ng/ml，血浆蛋白的终浓度为40～60ng/ml。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，待细胞增值启动并形成细胞团并且细胞密度达到2ⅹ107～5ⅹ107个/ml进行所述第二次培养；待细胞密度达到2ⅹ107～5ⅹ107个/ml时进行第三次培养；优选地，所述第一次培养的培养天数为3～6天，第二次培养的培养天数为10～12天。4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，在所述第二次培养与第三次培养之间，和/或，在第三次培养之后，还包括加入C型培养基进行培养；优选地，在所述第二次培养与第三次培养之间，当细胞密度达到2ⅹ107～5ⅹ107个/ml时，加入C型培养基，在第三次培养之后，当细胞密度达到2ⅹ107～5ⅹ107个/ml时，加入C型培养基；C型...

【专利技术属性】
技术研发人员：麦志国，谢新波，
申请(专利权)人：广州筑康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44