一种自体γδ-Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒技术

本发明专利技术涉及免疫细胞体外培养技术领域，尤其涉及一种自体γδ‑Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒。一种自体γδ‑Τ细胞制备方法主要包括单核细胞提取，采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶，γδ‑Τ细胞诱导、活化、与增值，收取全部γδ‑Τ细胞，γδ‑Τ细胞杀瘤活性测定等。用于实施该自体γδ‑Τ细胞制备方法的试剂盒包括盒体、盒盖、基座、细胞激活剂包被液试剂管、γδ‑Τ细胞刺激液试剂管、γδ‑Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ‑Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管。本发明专利技术的自体γδ‑Τ细胞制备方法获得的γδ‑Τ细胞纯度、数量、杀瘤性和活性均能达到较优水平，且避免了其它外来细胞所产生的免疫排斥反应；本发明专利技术的用于制备自体γδ‑Τ细胞的试剂盒结构简单、使用方便。

A method for preparing autologous gamma delta-b cells and a kit for implementing the method

The invention relates to the technical field of in vitro culture of immune cells, in particular to a method for preparing autologous gamma delta T cells and a kit for implementing the method. A method for preparing autologous gamma-delta-T cells mainly includes extraction of monocytes, encapsulation of cell culture flasks with cell activating agent, induction, activation, and increment of gamma-delta-T cells, collection of all gamma-delta-T cells, determination of gamma-delta-T cell killing activity, etc. The kit for implementing the autologous gamma delta The purity, quantity, tumoricidal activity and immune rejection reaction produced by other foreign cells can be avoided. The kit for preparing autologous gamma delta ___cells by the method of autologous gamma delta cell preparation has simple structure and convenient use.

【技术实现步骤摘要】
一种自体γδ-Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒
本专利技术涉及免疫细胞体外培养
，尤其涉及一种自体γδ-Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒。
技术介绍
γδ-Τ细胞是机体免疫系统的重要组成部分，通过多种方式参与机体抗肿瘤免疫反应。γδ-Τ细胞能以MHC限制性或非MHC限制性方式特异性识别靶细胞，并通过两条独立的途径直接溶解杀伤靶细胞：一方面，分泌穿孔素和颗粒酶以杀伤肿瘤细胞，穿孔素和颗粒酶以杀伤肿瘤细胞，穿孔素在Ca2+存在的条件下可以插入靶细胞膜，经多聚化形成管状结构，从而破坏细胞的细胞膜结构，杀伤靶细胞，颗粒酶是一类丝氨酸酯酶，进入胞浆后可以直接活化胞浆中的蛋白酶，促进细胞凋亡；另一方面，在γδ-Τ细胞识别肿瘤细胞后，细胞表面表达的高水平FasL与肿瘤细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发肿瘤细胞内部的程序性凋亡，达到肿瘤杀伤效果。除了直接裂解肿瘤细胞，γδ-Τ细胞还能分泌TNF-a抑制肿瘤血管形成，以达到抑制肿瘤生长的抗肿瘤作用。目前，国内体外培养γδ-Τ细胞方法主要是，采用免疫磁珠对单个核细胞进行细胞分选后再扩增的方法，这种方法分离出的细胞虽然纯度较高，但大大增加了研究成本，而且因为缺乏成熟的分选后体外培养工艺，所以很难在体外扩增，无法满足临床回输所需的细胞数量。因此，国内目前的γδ-Τ细胞培养试剂盒或γδ-Τ细胞培养方法在细胞数量、细胞纯度和杀瘤性上不能满足临床和科研需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细胞纯度、数量、杀瘤性和活性均能达到较优水平的一种自体γδ-Τ细胞制备方法。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于实施该自体γδ-Τ细胞制备方法的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种自体γδ-Τ细胞制备方法，包括以下步骤：(1)单核细胞提取：从外周血或脐带血中提取单核细胞；(2)采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶；其中，细胞激活剂包被液为采用PBS稀释抗CD3抗体细胞激活剂至10ng/mL；(3)将单核细胞用NK细胞扩增基础培养基调整细胞浓度为1×106～2×106/mL后接种于包被好的T75细胞培养瓶中，并加入20～30mLγδ-Τ细胞刺激液以及体积分数为5～8％的自体灭活血浆，开始刺激细胞，并记为D0天；其中，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及IL-18，γδ-Τ细胞刺激液含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及Zoledronate；(4)D3天解除刺激，从T75细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞转移离心管离心，弃掉上清，将沉淀打散，用γδ-Τ细胞扩增培养基调整细胞浓度为0.5×106～2.0×106个/mL后接种于新的包被好的T75细胞培养瓶中，并加入γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为8～10％的自体血浆，每隔3天计数并补液；其中，γδ-Τ细胞扩增培养基含有IL-2以及IL-18；(5)D5天补液，取出T75细胞培养瓶，然后用移液管混匀，取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按照1.0×105～1.0×106个/mL补加γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为5～8％的自体血浆，依据补液量更换包被好的175cm2细胞培养瓶或1000ml细胞培养袋；(6)D14～D20收取细胞培养瓶或细胞培养液中的全部细胞。进一步的，步骤(2)中包被细胞培养瓶的步骤为：取1-5ml细胞激活剂包被液于细胞培养瓶中，36℃过夜后，吸弃细胞培养瓶中PBS，再置于4℃冰箱中放置2.5～4个月。进一步的，γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为10％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为5μΜ/mL的Zoledronate。进一步的，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为10％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为50U/mL的IL-18。进一步的，γδ-Τ细胞扩增培养基含有终浓度为350～500U/mL的IL-2、以及终浓度为50U/mL的IL-18。本专利技术的一种自体γδ-Τ细胞制备方法，具有以下有益效果：1、本专利技术的自体γδ-Τ细胞制备方法采用单纯因子体外诱导扩增γδ-Τ细胞，利用自体免疫细胞体外高效增殖成γδ-Τ细胞，其细胞纯度、数量、杀瘤性和活性均能达到较优水平，且避免了其它外来细胞所产生的免疫排斥反应。2、本专利技术的自体γδ-Τ细胞制备方法包括γδ-Τ细胞扩增基础培养基、γδ-Τ细胞刺激液、以及γδ-Τ细胞扩增培养基，从而实现了γδ-Τ细胞在不同时期的诱导、活化、与增值，根据不同时期的需求进行设计，从而提供了一种γδ-Τ细胞增值速度较快、活性较高的γδ-Τ细胞制备方法。3、本专利技术不仅具有较好的安全性，而且加入的因子种类较少，操作更简单、质量更稳定、技术成本更低廉，适用于大规模培养和肿瘤临床治疗。4、本专利技术包被的抗CD3抗体，可以直接快速有效的使γδ-Τ细胞受到信号刺激，活化γδ-Τ细胞，促进细胞因子的合成，显著提高γδ-Τ细胞的杀瘤性。5、本专利技术的自体γδ-Τ细胞制备方法在包被好的T75培养瓶中培养7天左右后，再将细胞转入大的细胞培养瓶或细胞培养袋中，这样既可以保证γδ-Τ细胞被充分激活，又避免了高浓度抗体对细胞的持续作用诱发的凋亡，并且同等条件下细胞培养袋的效果要优于细胞培养瓶。6、本专利技术的自体细胞γδ-Τ制备方法经测定其细胞纯度高达85％～90％；杀瘤性高达75％～80％，增值率达到950倍；在其平行试验中，γδ-Τ细胞在细胞比例、杀瘤性、增值率指标上比较稳定，所以此专利技术方法不仅可以用在试剂盒研究而且能够满足临床需求，是目前为止γδ-Τ细胞体外培养最优方法。为了实现上述目的，本专利技术还提供了一种用于实施该自体γδ-Τ细胞制备方法的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，包括盒体、盒盖、基座、细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管，其中：盒体为顶面开口的不封闭盒体；盒盖可扣合在盒体上，用于封闭盒体；基座固定设置在盒体内；细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管可移除的插入在基座上。进一步的，细胞激活剂包被液试剂管包括PBS试剂管以及抗CD3抗体细胞激活剂试剂管；γδ-Τ细胞刺激液试剂管包括细胞扩增添加剂试剂管、L-谷氨酰胺试剂管、Zoledronate试剂管；γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管包括细胞扩增添加剂试剂管、L-谷氨酰胺试剂管、IL-18试剂管；γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管包括IL-2试剂管以及IL-18试剂管。进一步的，细胞激活剂包被液试剂管盛放有细胞激活剂包被液，细胞激活剂包被液含有10ng/mL的抗CD3抗体细胞激活剂；γδ-Τ细胞刺激液试剂管盛放有γδ-Τ细胞刺激液，γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为5μΜ/mL的Zoledronate；γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管盛放有γδ-Τ细胞扩增基础培养基，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自体γδ‑Τ细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)单核细胞提取：从外周血或脐带血中提取单核细胞；(2)采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶；其中，所述细胞激活剂包被液为采用PBS稀释抗CD3抗体细胞激活剂至10ng/mL；(3)将单核细胞用γδ‑Τ细胞扩增基础培养基调整细胞浓度为1×10

【技术特征摘要】
1.一种自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)单核细胞提取：从外周血或脐带血中提取单核细胞；(2)采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶；其中，所述细胞激活剂包被液为采用PBS稀释抗CD3抗体细胞激活剂至10ng/mL；(3)将单核细胞用γδ-Τ细胞扩增基础培养基调整细胞浓度为1×106～2×106/mL后接种于包被好的T75细胞培养瓶中，并加入20-30mlγδ-Τ细胞刺激液以及体积分数为5～8％的自体血浆，开始刺激细胞，并记为D0天；其中，所述γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及IL-12，所述γδ-Τ细胞刺激液含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及Zoledronate；(4)D3天解除刺激，从T75细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞转移离心管离心，弃掉上清，将沉淀打散，用γδ-Τ细胞扩增培养基调整细胞浓度为0.5×106～2.0×106个/mL后接种于新的T75细胞培养瓶中，并加入γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为8～10％的自体血浆，每隔3天计数并补液；其中，所述γδ-Τ细胞扩增培养基含有IL-2以及IL-18；(5)D5天补液，取出T75细胞培养瓶，然后用移液管混匀，取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按照1×105～1.0×106个/mL补加γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为5～8％的自体血浆，依据补液量更换175cm2细胞培养瓶或1000ml细胞培养袋；(6)D14～D20收取细胞培养瓶或细胞培养液中的全部细胞。2.根据权利要求1所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，步骤(2)中包被细胞培养瓶的步骤为：取1-5ml细胞激活剂包被液于细胞培养瓶中，36℃过夜后，吸弃细胞培养瓶中PBS，再置于4℃冰箱中放置2.5～4个月。3.根据权利要求1所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，所述γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为10％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为5μΜ/mL的Zoledronate。4.根据权利要求1所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，所述γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为50U/mL的IL-18。5.根据权利要求1所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，所述NK细胞扩增培养基含有终浓度为350-500U/mL的IL-2。6.一种用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，其用于实施权利要求1-5中任一项所述的自...

【专利技术属性】
技术研发人员：金浩范，孔伟圣，
申请(专利权)人：金浩范，孔伟圣，
类型：发明
国别省市：吉林,22