一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。

A Prokaryotic Secretory Expression System of Exogenous Proteins and Its Application

The present invention provides a prokaryotic secretion expression system for exogenous proteins and its application, which can produce exogenous target proteins in large quantities by means of exocrine secretion, and is easy to purify and operate, and has high popularization and application value.

【技术实现步骤摘要】
一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用。
技术介绍
蛋白/基因表达是指结构基因在生物体(宿主)中的转录、翻译以及加工过程；基因工程技术中所谓的外源蛋白表达则是指将获得的外源基因片段通过载体重组到一个基因表达宿主中，使其能产生具有生物活性大量蛋白表达产物，是当今分子生物学领域应用最广泛的技术手段之一。随着生物工业生产工艺的发展，利用该技术已经成功生产出多种疫苗、生化药物、工业酶等具有重要功能或用途的蛋白、多肽类生物产品。生命科学的各个领域对高纯度、高产量和高稳定性的重组功能蛋白的需求日益增长，这使得外源蛋白表达技术成为基因工程、生物制药研究和应用的重要内容，也是生命科学研究领域的热点之一。含有目的基因的宿主能否高效表达外源蛋白取决于多种因素，主要包括基因的结构特征、表达系统(宿主菌、载体)和细胞培养等多个方面，其中，外源基因的表达系统是影响蛋白表达的关键因素之一。一个理想的表达体系应具备目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高，而且表达产物容易分离纯化等特点。然而，高产量、高纯度的蛋白表达、生产仍然是目前的瓶颈技术，其主要原因是缺乏可用于生产外源蛋白的分泌表达系统。蛋白表达系统的宿主可以为原核细胞(细菌)或真核细胞(酵母、植物细胞、动物细胞等)。酵母作为表达工具表达产量通常较低，表达质粒易于丢失，外源整合基因不稳定，较难用于外源蛋白的产业化；而哺乳类细胞、昆虫细胞等表达系统，虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，但操作复杂、表达水平低，产业化生产造价昂贵，不易普遍推广使用。原核蛋白表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是由于目前以大肠杆菌为代表的多数原核细胞在大量生产时，其表达的外源目的蛋白常以包涵体形式表达，为胞内不溶性表达，活性产物分离纯化困难，需要通过复性等复杂的步骤才能部分恢复活性，从而限制了其应用。相比之下，如果外源蛋白能以“胞外分泌”的形式表达，产物分泌至细胞外的培养基中，则具有较大的优势：蛋白一般可溶，在分泌的过程中能获得有生物活性的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难，不仅利于表达蛋白的纯化，还大大减小了毒性蛋白对细胞的毒害作用。因此，外源蛋白的胞外分泌表达被认为是利用基因工程技术生产外源蛋白质的最佳方式。枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌等工程菌有更加完整的分泌体系，蛋白在胞内表达后能够直接以可溶的形式分泌释放到培养基中，即“分泌表达”，形成包涵体少，目的蛋白的回收相对简单，但其在表达外源蛋白的同时，往往自身也会向胞外分泌大量的蛋白酶，使外源蛋白无法稳定存在。
技术实现思路
本专利技术提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。根据本专利技术实施例的第一个方面，提供一种外源蛋白原核分泌表达系统，包括工程菌和基因原核表达载体，其中该工程菌为布鲁氏菌单胞菌，该基因原核表达载体为BMEI0742基因原核表达载体；根据GenBank中登录的布鲁氏菌(NC－003317)BMEI0742基因序列设计引物，序列为5'→3'；PCR引物为上游同源臂的上游引物UP-F和下游同源臂的下游引物DOWN-R，模板为上、下游同源臂纯化产物；以布鲁氏菌16M株的灭活菌液为样本，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系反应条件为:90℃5min；88℃40s，60℃45s，70℃1min，40个循环；最后70℃1min；反应结束后，PCR产物4℃保存或直接进行1％琼脂糖凝胶凝胶电泳；回收目的基因片段，并将回收后目的基因片段与pMD19－T载体在16℃水浴条件下进行连接，构建重组质粒pMD19－T－BMEI0742；其中，PCR反应体系组份为：2×EsTaqMastermix，共10.0μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，模板2μL，去离子水7.6μL；连接体系组份为：目的基因6.5μL，pMD19－T载体0.5μL，T4DNAligaseBuffer2.0μL，T4DNAligase1.0μL；重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，进行菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆；并将提取的质粒进行测序后正确的质粒pMD19－T－BMEI0742和pET－28a载体用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET－28a载体；将目的片段和线性pET－28a载体在T4连接酶的作用下16℃水浴连接，连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；经卡那抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆，进行菌液PCR验证和酶切鉴定；将筛选出的阳性克隆菌在LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床中培养过夜，将培养过夜的菌液按1∶100的比例接种至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、200r/min条件下培养约1h，使其D600nm值为0.4～0.6，在其他条件不变的情况下，按照不同的诱导剂(IPTG)浓度(终浓度为0.2、0.6、1.0mmol/L)诱导不同时间(0、4、6、8h)后收集菌体；取1mL菌液离心后，弃掉上清，并在离心管中按照1∶4的比例加入经过稀释的1×SDS蛋白上样缓冲液，在振荡器上振荡使菌体和蛋白上样液充分混匀，在金属加热器上100℃加热10min，取20μL样品进行15％蛋白电泳，观察电泳结果；筛选目的基因的最佳表达条件，并以最佳的诱导表达条件进行大量诱导表达，采用AKTA蛋白纯化系统纯化后进行SDS－PAGE电泳鉴定。根据本专利技术实施例的第二个方面，提供如本专利技术实施例的第一个方面所述的外源蛋白原核分泌表达系统在制备外源蛋白中的用途。本专利技术提出一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。一种外源蛋白原核分泌表达系统，包括工程菌和基因原核表达载体，其中该工程菌为布鲁氏菌单胞菌，该基因原核表达载体为BMEI0742基因原核表达载体；根据GenBank中登录的布鲁氏菌(NC－003317)BMEI0742基因序列设计引物，序列为5'→3'；PCR引物为上游同源臂的上游引物UP-F和下游同源臂的下游引物DOWN-R，模板为上、下游同源臂纯化产物；以布鲁氏菌16M株的灭活菌液为样本，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系反应条件为:90℃5min；88℃40s，60℃45s，70℃1min，40个循环；最后70℃1min；反应结束后，PCR产物4℃保存或直接进行1％琼脂糖凝胶凝胶电泳；回收目的基因片段，并将回收后目的基因片段与pMD19－T载体在16℃水浴条件下进行连接，构建重组质粒pMD19－T－BMEI0742；其中，PCR反应体系组份为：2×EsTaqMastermix，共10.0μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，模板2μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外源蛋白原核分泌表达系统，其特征在于，包括工程菌和基因原核表达载体，其中该工程菌为布鲁氏菌单胞菌，该基因原核表达载体为BMEI0742基因原核表达载体；根据GenBank中登录的布鲁氏菌(NC－003317)BMEI0742基因序列设计引物，序列为5'→3'；PCR引物为上游同源臂的上游引物UP‑F和下游同源臂的下游引物DOWN‑R，模板为上、下游同源臂纯化产物；以布鲁氏菌16M株的灭活菌液为样本，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系反应条件为:90℃5min；88℃40s，60℃45s，70℃1min，40个循环；最后70℃1min；反应结束后，PCR产物4℃保存或直接进行1％琼脂糖凝胶凝胶电泳；回收目的基因片段，并将回收后目的基因片段与pMD19－T载体在16℃水浴条件下进行连接，构建重组质粒pMD19－T－BMEI0742；其中，PCR反应体系组份为：2×Es Taq Master mix，共10.0μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，模板2μL，去离子水7.6μL；连接体系组份为：目的基因6.5μL，pMD19－T载体0.5μL，T4 DNA ligase Buffer 2.0μL，T4 DNA ligase 1.0μL；重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，进行菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆；并将提取的质粒进行测序后正确的质粒pMD19－T－BMEI0742和pET－28a载体用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET－28a载体；将目的片段和线性pET－28a载体在T4连接酶的作用下16℃水浴连接，连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；经卡那抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆，进行菌液PCR验证和酶切鉴定；将筛选出的阳性克隆菌在LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床中培养过夜，将培养过夜的菌液按1∶100的比例接种至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、200r/min条件下培养约1h，使其D600nm值为0.4～0.6，在其他条件不变的情况下，按照不同的诱导剂(IPTG)浓度(终浓度为0.2、0.6、1.0mmol/L)诱导不同时间(0、4、6、8h)后收集菌体；取1mL菌液离心后，弃掉上清，并在离心管中按照1∶4的比例加入经过稀释的1×SDS蛋白上样缓冲液，在振荡器上振荡使菌体和蛋白上样液充分混匀，在金属加热器上100℃加热10min，取20μL样品进行15％蛋白电泳，观察电泳结果；筛选目的基因的最佳表达条件，并以最佳的诱导表达条件进行大量诱导表达，采用AKTA蛋白纯化系统纯化后进行SDS－PAGE电泳鉴定。...

【技术特征摘要】
1.一种外源蛋白原核分泌表达系统，其特征在于，包括工程菌和基因原核表达载体，其中该工程菌为布鲁氏菌单胞菌，该基因原核表达载体为BMEI0742基因原核表达载体；根据GenBank中登录的布鲁氏菌(NC－003317)BMEI0742基因序列设计引物，序列为5'→3'；PCR引物为上游同源臂的上游引物UP-F和下游同源臂的下游引物DOWN-R，模板为上、下游同源臂纯化产物；以布鲁氏菌16M株的灭活菌液为样本，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系反应条件为:90℃5min；88℃40s，60℃45s，70℃1min，40个循环；最后70℃1min；反应结束后，PCR产物4℃保存或直接进行1％琼脂糖凝胶凝胶电泳；回收目的基因片段，并将回收后目的基因片段与pMD19－T载体在16℃水浴条件下进行连接，构建重组质粒pMD19－T－BMEI0742；其中，PCR反应体系组份为：2×EsTaqMastermix，共10.0μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，模板2μL，去离子水7.6μL；连接体系组份为：目的基因6.5μL，pMD19－T载体0.5μL，T4DNAligaseBuffer2.0μL，T4DNAligase1.0μL；重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，进行菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆；并将提取的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，吴娟，寇小娟，
申请(专利权)人：武汉巴菲尔生物技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42